多系統萎縮患者皮膚組織中泛素和α-突觸核蛋白的表達*

張瑞鋒，殷競爭，周玉帥，滕軍放#

1)鄭州大學第一附屬醫院神經內科 鄭州 450052 2)河南省高等學校臨床醫學重點學科開放實驗室 鄭州 450052

多系統萎縮患者皮膚組織中泛素和α-突觸核蛋白的表達*

張瑞鋒1，2)，殷競爭1，2)，周玉帥1，2)，滕軍放1，2)#

1)鄭州大學第一附屬醫院神經內科 鄭州 450052 2)河南省高等學校臨床醫學重點學科開放實驗室 鄭州 450052

#通信作者，男，1960年11月生，博士，教授，主任醫師，研究方向:神經退行性疾病，E-mail:13838210077@163.com

多系統萎縮；皮膚活檢；泛素蛋白酶體系統；α-突觸核蛋白

目的：檢測多系統萎縮(MSA)患者皮膚組織中泛素(Ub)和α-突觸核蛋白表達的變化，探討泛素蛋白酶體系統在MSA發病機制中的作用。方法：收集5例MSA患者及8例正常對照的皮膚標本，采用免疫組化法和Western blot方法分別檢測Ub及α-突觸核蛋白的細胞定位及表達情況。結果：與正常對照組相比，MSA患者皮膚表皮層中Ub[(0.021±0.006)vs(0.429±0.009)]及α-突觸核蛋白[(0.035±0.015)vs(0.111±0.021)]的表達均上調(t=3.974和3.321，P<0.05)。結論：泛素蛋白酶體系統可能參與了MSA的發病。

多系統萎縮(multiple system atrophy，MSA)是一組成年期發病、呈散發性的神經系統變性疾病，臨床較為少見，主要表現為不典型的帕金森綜合征、小腦性共濟失調、不同程度的自主神經功能障礙和錐體系統累及等癥狀[1-2]。由于MSA病情進展較快，且目前尚無有效的治療手段，多數預后不良。其病理學表現為α-突觸核蛋白異常聚集在少突膠質細胞內，形成嗜酸性包涵體，導致少突膠質細胞變性，從而造成神經元變性、死亡[2]。泛素蛋白酶體系統(ubiquitin proteasome system，UPS)是真核細胞內重要的蛋白降解途徑，參與細胞內80%以上正常和異常蛋白質降解的過程[3]。α-突觸核蛋白主要通過泛素蛋白酶體通路(ubiquitin proteasome pathway，UPP)降解。病理組織學證實在黑質-紋狀體通路和橄欖腦橋小腦通路內的膠質細胞存在高密度的胞質內包涵體并伴有神經元喪失和膠質細胞增生等病理改變可以確診MSA[4]，但在患者生前難以有效開展病理組織學檢查，為此，作者通過對MSA患者行皮膚活檢術，檢測皮膚組織中泛素(ubiquitin，Ub)和α突觸核蛋白的表達情況，探討UPS在MSA患者表皮中的異常調控情況。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2012年9月至2014年6月在鄭州大學第一附屬醫院神經內科就診的5例MSA患者，均符合2008年修訂的Gilman診斷標準，無其他神經系統疾病合并癥。正常對照組(8例)為該院外科手術的患者，排除神經系統變性疾病以及其他慢性疾病。該研究通過該院倫理委員會批準，所有受試者或家屬知情同意并簽署知情同意書。對所有入組患者進行全面的病史采集，包括年齡、性別、早期癥狀、病情進展情況、生活環境、工作性質、家族史、有無大量飲酒史、有無神經毒性藥物服用史、有無神經病變危險因素接觸史、有無其他慢性疾病合并癥等。由研究者(神經內科醫師)對MSA患者進行統一的多系統萎縮評分量表評估。

1.2 皮膚活檢 選取MSA患者一側肘關節上方約10～15 cm處上臂外側部皮膚，用碘伏溶液常規消毒，20 g/L利多卡因對定位皮膚做逐層浸潤麻醉。麻醉成功后，左手固定皮膚，右手持手術刀在擬取材處垂直進刀，沿皮紋方向，行長約1 cm的縱行切口，梭形切下1 mm×1 cm大小的全層皮膚組織，平均分為2部分，分別投入40 g/L多聚甲醛/PBS緩沖液中固定及液氮中低溫凍存。取皮后縫合切口、消毒、無菌紗布加壓包扎，7 d后拆線。

1.4 皮膚組織中Ub和α-突觸核蛋白表達的檢測

1.5 統計學處理 采用SPSS 17.0進行分析，應用兩獨立樣本的t檢驗比較2種皮膚組織中Ub和α-突觸核蛋白表達的差異，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 2種皮膚組織中Ub及α-突觸核蛋白的分布

見圖1。高倍鏡下可見在MSA患者皮膚表皮層中彌漫分布著免疫反應陽性細胞，其胞質和胞核可見棕褐色或棕黃色、粗糙顆粒狀著色。

圖1 2種皮膚組織中Ub(A)和α-突觸核蛋白(B)的表達定位(SP,×320)

2.2 2種皮膚組織中Ub和α-突觸核蛋白的表達

見圖2、表1。

圖2 皮膚組織中Ub和α-突觸核蛋白的表達

組別nUbα-突觸核蛋白正常對照組80.021±0.0060.035±0.015MSA組50.429±0.0090.111±0.021t3.9743.321P0.0360.047

3 討論

MSA是一組累及黑質-紋狀體系統、橄欖腦橋小腦系統和自主神經系統的α-突觸核蛋白病，該病病因及發病機制尚不十分清楚，可能與遺傳易感性和環境因素有關[4]。MSA的病理學標志是神經膠質細胞胞質內嗜酸性包涵體形成，其核心成分為α-突觸核蛋白。目前的研究[5]表明，α-突觸核蛋白是一種突觸前蛋白，在細胞內沉積，甚至聚集形成包涵體，具有神經毒性，可影響突觸末梢遞質的釋放以及細胞間信號的傳導，最終導致神經細胞變性、死亡。α-突觸核蛋白的降解依賴UPS的正常調控，故UPS在MSA發病機制中所起的作用被越來越多的研究者關注，UPS的調節有望成為治療MSA及其他神經變性疾病的一個新方向。

UPS在細胞內發揮降解清除蛋白的作用，主要清除細胞內發生突變、損傷及錯誤折疊的蛋白質。UPS的功能缺陷將會引起細胞內泛素依賴途徑的蛋白質降解障礙，引起細胞功能損傷，甚至變性、死亡[6-7]。因此維持UPS正常的生理功能對于調控蛋白質降解和保障細胞內正常的新陳代謝至關重要。UPS由Ub及一系列相關酶組成，可通過檢測Ub的表達水平來評估UPS的調控功能是否發生異常。王雪晶等[5]運用皮膚活檢術以皮膚組織為標本研究了自噬異常調控在帕金森病(Parkinson′s disease，PD)發病機制中的作用，提示皮膚組織或可成為研究PD的活檢點。作者對5例MSA患者的皮膚進行活檢，通過Ub及α-突觸核蛋白這兩個指標來評估UPS的調控水平，結果表明，與正常對照組相比，MSA患者皮膚組織中Ub及α-突觸核蛋白的表達水平均明顯上調，提示MSA患者機體內UPS的調控功能可能發生紊亂。UPS功能障礙可能在多種神經系統變性疾病的發生中扮演重要角色。研究[8]表明PD的發病與UPS中底物蛋白的泛素化障礙、去泛素化障礙及蛋白酶體自身功能障礙均有關系；在PD、路易體癡呆等其他神經變性病患者的病理切片中均發現有α-突觸核蛋白異常聚集，甚至形成包涵體；這些疾病的病理結果提示神經變性疾病的發病可能與UPS通路的功能障礙有關，因此MSA、PD和路易體癡呆也被一起歸類為突觸核蛋白病。

α-突觸核蛋白廣泛聚集引起的神經元變化與MSA的癥狀有一致性。任曉琳[9]通過研究MSA患者磁共振彌散張量成像(DTI)的特點，發現MSA病例中下橄欖核、小腦白質及小腦中腳、腦橋、黑質、殼核等部位發生顯著病變，且與疾病的嚴重程度和小腦性共濟失調癥狀成正相關，DTI直觀顯示病變嚴重的患者神經纖維走行紊亂、排列稀疏，嚴重者有斷裂。MSA的組織學特征是少突膠質細胞內出現α-突觸核蛋白陽性的包涵體。有研究[10]表明腦橋核和殼核在早期階段即形成α-突觸核蛋白陽性的神經元核內包涵體,隨后神經元胞質包涵體亦形成。

1998年Wakabayashi等[11]發現α-突觸核蛋白聚集引起少突膠質細胞病變，從而引起神經元髓鞘變性脫失，激活小膠質細胞，誘發氧化應激，進而導致神經元變性、死亡。另有研究[10]發現，MSA患者神經元中亦出現了異常聚集的α-突觸核蛋白，其形成的嗜酸性包涵體分布于胞質、胞核、突觸等部位，或可直接造成神經元變性、死亡。因此猜測，無論是髓鞘軸突變性引起的神經元脫失還是神經元本身直接參與，二者或可共同促進MSA的退變過程。朱敏等[12]在研究MPTP對中腦黑質神經元線粒體表達α-突觸核蛋白及線粒體形態改變的影響過程中發現，MPTP可以誘導線粒體α-突觸核蛋白水平的升高，并導致線粒體出現碎片化，碎片化的線粒體結構與α-突觸核蛋白共定位，猜測線粒體α-突觸核蛋白水平的升高可能與其碎片化密切相關。此外，MSA患者全基因組單核苷酸多態性關聯分析顯示，α-突觸核蛋白基因(SNCA)rs11931074、rs3857059、rs3822086位點單核苷酸多態性亦可增加MSA的患病風險[4]。因此預防該蛋白聚集形成包涵體或許可為MSA的治療提供一個新的突破方向。研究[13-14]表明，利福霉素在體外有抑制α-突觸核蛋白聚集的功能，動物模型實驗也提示利福霉素可減少α-突觸核蛋白單體生成，并抑制其聚集形成包涵體，從而延緩MSA病情進展。其他一些可能延緩MSA疾病進展、有神經保護作用的藥物如米諾環素、單胺氧化酶抑制劑(MAO-B)雷沙吉蘭等亦在不斷研究開發中，但還需要大量的臨床試驗去證實[15-16]。

綜上所述，MSA的發病機制復雜多樣，可能是多種機制共同參與、交叉作用的結果。該研究初步探討了UPS異常調控在MSA發病機制中的作用，可能對MSA疾病診斷及病情評估有一定的價值，然而目前關于MSA的研究較少，而且我國也缺乏較為完整的流行病學資料，因此還需要更大樣本量、更多更深入的研究去進一步證實。

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(2014-10-27 收稿 責任編輯趙秋民)

Expressions of α-synuclein and ubiquitin in skin tissue of patients with multiple system atrophy

ZHANGRuifeng1，2)，YINJingzheng1，2)，ZHOUYushuai1，2)，TENGJunfang1，2)

1)DepartmentofNeurology,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 2)Key-DisciplinesLaboratoryforClinicalMedicineofHenanProvince，Zhengzhou450052

multiple system atrophy;skin biopsy;ubiquitin proteasome system;α-synuclein

Aim: To study the function of ubiquitin and α-synuclein in multiple system atrophy(MSA) patients by the skin biopsy,and to explore the role of ubiquitin proteasome system in the pathogenesis of MSA. Methods: The samples included 5 MSA patients and 8 normal controls. Immunohistochemistry and Western blot were used to detect the expressions of ubiquitin and α-synuclein in skin tissue. Results: Compared with normal control group,the expressions of ubiquitin[(0.021±0.006)vs(0.429±0.009)] and α-synuclein[(0.035±0.015)vs(0.111±0.021)] in the skin epidermal layer of MSA group were raised(t=3.974,3.321;P<0.05).Conclusion: Ubiquitin proteasome system may be involved in the pathogenesis of MSA.

10.13705/j.issn.1671-6825.2015.03.013

*鄭州市科技攻關計劃項目 131PLJRC675

R742.5