魚腥草揮發(fā)油抗淋巴瘤細胞譜效關(guān)系*

張壯麗，趙 寧，趙志鴻，張小俊，王桂芳

1)河南省醫(yī)藥科學(xué)研究院藥化室 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)藥學(xué)院 鄭州 450001

魚腥草揮發(fā)油抗淋巴瘤細胞譜效關(guān)系*

張壯麗1)△，趙 寧2)，趙志鴻1)，張小俊1)，王桂芳1)

1)河南省醫(yī)藥科學(xué)研究院藥化室 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)藥學(xué)院 鄭州 450001

△女，1978年1月生，博士，助理研究員，研究方向：中藥新藥，E-mail：zzl7814@163.com

魚腥草揮發(fā)油；GC-MS；譜效關(guān)系；淋巴瘤

目的：以魚腥草揮發(fā)油GC-MS特征譜峰面積和其對Raji細胞的抑制率為基礎(chǔ)進行譜效關(guān)系分析，以確定魚腥草揮發(fā)油抗腫瘤的藥效成分組。方法：通過GC-MS技術(shù)獲取不同產(chǎn)地魚腥草揮發(fā)油的色譜圖，通過MTT實驗考察不同產(chǎn)地魚腥草揮發(fā)油對Raji細胞的抑制率，采用偏最小二乘回歸分析技術(shù)對色譜峰與抑制率的內(nèi)在聯(lián)系進行譜效分析。結(jié)果：GC-MS特征譜中色譜峰6、14、15、22、25、26、27和細胞抑制率具有較強的正相關(guān)關(guān)系，其代表物質(zhì)對抗腫瘤藥效貢獻較大，為抗腫瘤藥效成分組。結(jié)論：魚腥草揮發(fā)油的抗腫瘤作用是多種成分共同作用的結(jié)果。

魚腥草為三白草科蕺菜屬植物蕺菜全草，具有清熱解毒、消腫排膿、利尿通淋的功效。魚腥草揮發(fā)油是該藥材的主要活性成分[1]，具有抗病毒、抗菌、抗炎、鎮(zhèn)咳、祛痰、抗過敏、利尿、增強機體免疫功能、抗腫瘤等藥理作用[2-9]。目前魚腥草揮發(fā)油的質(zhì)量鑒定主要以化學(xué)成分為指標(biāo)，與藥效脫節(jié)。該實驗采用偏最小二乘回歸分析(PLS)對13個產(chǎn)地的魚腥草揮發(fā)油氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)特征譜與揮發(fā)油對Raji細胞抑制率的內(nèi)在聯(lián)系進行譜效分析，建立特征峰面積對腫瘤細胞抑制率的回歸方程，以期找到魚腥草揮發(fā)油抗腫瘤的主要藥效成分。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 藥材 魚腥草樣品分別采收自四川、重慶和云南等主產(chǎn)地，其中四川、重慶地區(qū)7個產(chǎn)地：四川大邑縣出江鎮(zhèn)(編號1)，四川崇州三江鎮(zhèn)王橋村(編號2)，四川犍為縣(編號7)，四川雅安市(編號8)，重慶市(編號9)，四川巴中市平昌縣筆山鎮(zhèn)獅嶺村(編號10)，四川成都荷花池藥材市場(編號11)；云南省6個產(chǎn)地：云南西雙版納勐?？h南糯山(編號3)，云南保山市施甸縣舊城鄉(xiāng)(編號4)，云南保山市施甸縣仁和鄉(xiāng)(編號5)，云南保山市龍陵縣平達鄉(xiāng)(編號6)，云南玉溪市峨山縣小街鎮(zhèn)(編號12)，云南紅河州石屏縣異龍鎮(zhèn)(編號13)。

1.1.2 試劑和細胞株 正己烷(色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)，無水硫酸鈉(分析純，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司)，重蒸水、RPMI 1640培養(yǎng)基、DMSO(北京索萊寶生物醫(yī)藥科技有限公司)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，MTT(美國Sigma公司)。Raji細胞株(河南省醫(yī)藥科學(xué)研究院藥化室保存和自行傳代培養(yǎng))。

1.1.3 儀器 7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、Hp-5 MS毛細管色譜柱(美國安捷倫公司)，電子天平、生物安全柜、臺式高速冷凍離心機(香港力康發(fā)展有限公司)，顯微鏡[舜宇光學(xué)科技(集團)有限公司]，超凈工作臺[凈化設(shè)備(蘇州)公司]，高壓滅菌鍋(日本Hirayama公司)，CO2培養(yǎng)箱[施都凱儀器設(shè)備(上海)有限公司]，氣浴恒溫振蕩器(江蘇金壇市中大儀器廠)，酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad公司)，96孔板、50 mL細胞培養(yǎng)瓶(美國Corning公司)。

1.2 魚腥草揮發(fā)油的制備 將干燥魚腥草藥材粉碎后，稱取100 g，裝入2 000 mL圓底燒瓶中，加蒸餾水，混勻并浸泡一定時間后提取揮發(fā)油[10]。收集所得淺黃色揮發(fā)油，精密稱量，計算揮發(fā)油提取率，封裝、凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 不同產(chǎn)地魚腥草揮發(fā)油GC-MS特征譜的繪制

1.3.1 樣品溶液的配制 精密量取揮發(fā)油7.5 μL，加1.5 mL正己烷，并用無水硫酸鈉除水，5 000 r/min離心10 min，抽取上清液即得體積分數(shù)0.5%的樣品溶液。

MS條件：接口溫度280 ℃，電離方式為EI電離，電離能量70 eV，離子源溫度230 ℃，MS四級桿溫度150 ℃，溶劑延遲3 min，掃描質(zhì)量范圍:質(zhì)荷比 20～500 amu。

1.4 魚腥草揮發(fā)油對腫瘤細胞的抑制實驗 將制備好的13個產(chǎn)地的魚腥草揮發(fā)油加DMSO溶解，分別配制成體積分數(shù)0.100 0%、0.020 0%、0.004 0%、0.001 3%的樣品溶液。取96孔板，設(shè)置給藥組和空白組，將Raji單細胞懸液接種于96孔板，103～104個/孔，給藥組分別加入不同劑量揮發(fā)油溶液，空白組加等體積的空白培養(yǎng)液，加樣后總液量為100 μL/孔。將加完樣的96孔板置培養(yǎng)箱中于37 ℃、體積分數(shù)5% CO2條件下培養(yǎng)72 h。然后每孔加5 g/L的MTT 20 μL，在相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 h，取出后離心，小心棄去上清液，每孔加150 μL DMSO并將培養(yǎng)板置于微孔板振蕩器上振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。用酶標(biāo)儀在570 nm波長處測量各孔吸光度(A) 值，并計算細胞抑制率：抑制率=(1-給藥孔A值/空白孔A值)×100%。實驗重復(fù)3次。

1.5 PLS法分析譜效關(guān)系 以體積分數(shù)0.001 3%揮發(fā)油對腫瘤細胞的抑制率為因變量(Y)，以29個考察峰峰面積為自變量(X)，進行譜效關(guān)系分析。

2 結(jié)果

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 出峰情況考察 結(jié)果見圖1。所有成分均能在1 h內(nèi)出峰，且基本達到基線分離。

圖1 魚腥草揮發(fā)油GC-MS記錄圖

2.1.2 穩(wěn)定性考察 相對保留時間比值(RRT)和峰面積比值(RPA)的RSD值分別小于0.02%和2.57%，表明樣品溶液在24 h內(nèi)性質(zhì)穩(wěn)定。

2.1.3 精密度考察 RRT和RPA的RSD值分別小于0.10%和2.61%，表明儀器的精密度良好。

2.1.4 重復(fù)性考察 RRT和RPA的RSD值分別小于0.12%和2.63%，表明該方法的重復(fù)性較好。

2.2 譜圖分析 13個產(chǎn)地魚腥草揮發(fā)油的GC-MS色譜圖見圖2。特征峰鑒定結(jié)果見表1，經(jīng)譜庫檢索并參考文獻[11]，推測25號峰簇可能為表中所列幾個化合物的組合。

2.3 魚腥草揮發(fā)油對Raji細胞的抑制率 結(jié)果見表2。由表2可知，魚腥草揮發(fā)油對Raji細胞具有很好的抑制效果，揮發(fā)油劑量為體積分數(shù)0.001 3%時多數(shù)產(chǎn)地的魚腥草揮發(fā)油仍能達到50%左右的抑制率。

2.4 PLS法分析譜效關(guān)系 結(jié)果顯示回歸方程為：Y=1.003×10-13-0.261X1-0.281X2-0.018X3-0.165X4-0.226X5+0.192X6-0.201X7-0.030X8-0.273X9+0.036X10-0.114X11+0.058X12-0.063X13+0.099X14+0.201X15+0.025X16-0.142X17-0.040X18+0.039X19-0.065X20-0.076X21+0.281X22-0.353X23-0.037X24+0.393X25+0.137X26+0.101X27-0.160X28-0.076X29?？梢?，29個自變量的回歸系數(shù)有正、有負。其中X6、X14、X15、X22、X25、X26、X27和細胞抑制率具有較強的正相關(guān)關(guān)系，特征峰成分鑒定為對傘花烴、(-)-4-萜品醇、2,4,6-三甲基苯甲醇、甲基正壬酮、十一醇、正癸酸、乙酸香葉酯、2-十二烷酮和石竹烯。

圖2 13個產(chǎn)地魚腥草揮發(fā)油GC-MS特征譜

峰號t(保留)/min化合物峰號t(保留)/min化合物14.853α-蒎烯1613.034α-萜品醇25.274莰烯1713.584正癸醛35.971β-水芹烯1814.493正壬醇46.083β-蒎烯1915.522芳樟醇56.460β-月桂烯2016.265環(huán)辛烷67.541對傘花烴2116.833左旋乙酸冰片酯77.674D-檸檬烯2217.241甲基正壬酮88.648γ-萜品烯2318.002α-環(huán)香葉醇醋酸酯99.609萜品油烯2418.596癸酸甲酯1010.013紫蘇烯2520.851～21.582十一醇、正癸酸、乙酸香葉酯1110.130壬醛2621.9422-十二烷酮1212.135L-龍腦2723.003石竹烯1312.328正壬醇2827.8502-十三烷酮1412.544(-)-4-萜品醇2933.105氧化石竹烯1512.8282,4,6-三甲基苯甲醇

表2 魚腥草揮發(fā)油對Raji細胞的抑制率(n=3) %

3 討論

分析方法和數(shù)據(jù)處理技術(shù)是譜效關(guān)系研究的關(guān)鍵[12]。該實驗樣本數(shù)為13(產(chǎn)地)，遠少于自變量數(shù)(特征峰)，且中藥特征譜在建立譜效關(guān)系模型時色譜峰之間可能存在多重共線性，不適用普通多元線性回歸分析。PLS對于處理這類樣本量小、自變量多且變量間存在多重相關(guān)性問題的數(shù)據(jù)樣本具有獨特優(yōu)勢，并可同時實現(xiàn)回歸建模、數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)簡化以及2組變量間的相關(guān)分析，在最終模型中將包含原有的所有自變量，從而最大限度地利用數(shù)據(jù)信息[13]。

該實驗采用PLS方法對13個產(chǎn)地的魚腥草揮發(fā)油GC-MS特征峰峰面積與魚腥草揮發(fā)油對Raji細胞抑制率之間進行譜效關(guān)系分析。結(jié)果表明，特征峰6、14、15、22、25、26、27和細胞抑制率具有較強的正相關(guān)關(guān)系。由此可得出結(jié)論：魚腥草揮發(fā)油的抗淋巴瘤藥效物質(zhì)組包括對傘花烴、(-)-4-萜品醇、2,4,6-三甲基苯甲醇、甲基正壬酮、十一醇、正癸酸、乙酸香葉酯、2-十二烷酮和石竹烯，其對Raji細胞的抑制作用應(yīng)為這些物質(zhì)協(xié)同作用的結(jié)果。

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(2014-09-09 收稿 責(zé)任編輯姜春霞)

Spectrum-effect relationship of GC-MS spectrum of volatile oil from Houttuynia cordata Thunb with antilymphoma effect

ZHANGZhuangli1)，ZHAONing2)，ZHAOZhihong1)，ZHANGXiaojun1)，WANGGuifang1)

1)MedicalChemistrySection,HenanAcademyofMedicalandPharmaceuticalSciences,Zhengzhou450052 2)CollegeofPharmaceuticalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001

volatile oil from Houttuynia cordata Thunb; GC-MS; spectrum-effect relationship; lymphoma

Aim: To study the spectrum-effect relationship on the basis of GC-MS chromatogram and data of the inhibition rate on Raji cells, in order to definite the anti-tumor active ingredient of volatile oil from Houttuynia cordata Thunb. Methods: The inherent connections were studied between GC-MS chromatogram and inhibition rate with partial least squares regression analysis. Results: There were 7 peaks such asX6,X14,X15,X22,X25,X26,X27 of the GC-MS chromatogram played the most important role in the anti-tumor effect, with high positive relationship, and were determined as effective compounds. Conclusion: The anti-tumor effect of volatile oil from Houttuynia cordata Thunb is the result of combined effect of several components.

10.13705/j.issn.1671-6825.2015.03.018

*河南省省屬科研單位社會公益項目預(yù)研專項 2013,2014；河南省重點科技攻關(guān)計劃項目 142102310433

R285.5