男性原始生殖細胞中LIN28和OCT4的表達*

汪亞芬，馮涵琪，王興玲#，胡旭林，紀家葵，管一春，李 麗，劉 芳

1)鄭州大學第三附屬醫院生殖醫學科 鄭州 450052 2)清華大學醫學院干細胞與再生醫學中心 北京 100083

男性原始生殖細胞中LIN28和OCT4的表達*

汪亞芬1)，馮涵琪1)，王興玲1)#，胡旭林2)，紀家葵2)，管一春1)，李 麗1)，劉 芳1)

1)鄭州大學第三附屬醫院生殖醫學科 鄭州 450052 2)清華大學醫學院干細胞與再生醫學中心 北京 100083

#通信作者，女，1962年2月生，碩士，教授，研究方向：輔助生殖技術，E-mail：wangxl208@126.com

原始生殖細胞；LIN28；OTC4；男性

目的：分析LIN28在男性原始生殖細胞(PGCs)中的表達變化。方法：收集男性胚胎/胎兒，胎齡為7周、8周、9周、10周、11～12周、13～14周各3例。分離早期胚胎性腺組織，運用免疫熒光技術分析PGCs中LIN28和OCT4的表達。結果：6組睪丸組織中LIN28和OTC4陽性細胞百分數比較，差異均有統計學意義(F=15.651,6.501，P均<0.05)。胎齡第7～14周，OCT4一直定位于PGCs的細胞核中；胎齡第8～9周時，OCT4在PGCs中的表達低于第7周，第10～12周OCT4表達再次升高，而在第13周后，OCT4表達逐漸降低。從胎齡第7周開始直至第14周， PGCs中LIN28蛋白的表達逐漸增強，在胎齡第13～14周達到最高峰。在定位上，在胎齡第7周時LIN28表達于PGCs胞核內；在胎齡第8～9周時，PGCs胞核和胞質中均可觀察到LIN28的表達；而在胎齡第10周以后，部分PGCs僅胞質中表達LIN28；在胎齡第11～14周時LIN28均定位于PGCs的胞質中。結論：LIN28可能是一個可行的、比較穩定的雄性生殖細胞標記因子。

人類原始生殖細胞(primordial germ cells,PGCs)是各型生殖細胞的起源細胞(祖細胞)，在人類的生存和發展進程中發揮重要作用[1-2]。PGCs的成熟過程呈階段性發展并被精密地調控著[3]。胎齡2～3周時，人類早期胚胎開始出現PGCs。胎齡5～6周時，PGCs遷徙到原始生殖嵴。遷移后的PGCs經過一系列的擴增與初始分化，形成(5～7)百萬個卵原或精原細胞，這些原始細胞被支持細胞和體細胞圍繞，共同組成早期性腺。遷移后的PGCs時期是細胞增殖和性別分化的決定時期，內源性調控機制主要包括4個方面：RNA結合蛋白(RNA-binding protein，RBP)調控、轉錄因子調控、全能性基因調控和表觀遺傳調控[4-5]。LIN28是一種高度保守的RBP，是生殖細胞增殖和分化過程中必不可少的因子，與人類睪丸生殖細胞腫瘤的發生密切相關[6-7]。體外誘導實驗[8]發現，LIN28在人胚胎干細胞中高度表達，并且可以提高多能干細胞向生殖干細胞的轉化效率。八聚體結合轉錄因子4(octamer-binding transcription factor 4，OCT4)是一個著名的早期生殖細胞標記物，目前常用于生殖領域的研究標記[9-10]。作者對LIN28 和OCT4在男胎早期性腺組織中的表達情況進行了檢測，分析其在PGCs中表達的變化趨勢，以期找到適用于生殖細胞發育不同階段的標記物，為進一步揭示人類生殖細胞的發生、發育、成熟的調節機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 標本來源 研究經鄭州大學第三附屬醫院生殖倫理委員會批準，在患者簽署相應的知情同意書后，收集標本，其中多胎妊娠減胎術后廢棄胚胎4例，人工流產、藥物流產后廢棄胚胎/胎兒20例，引產清宮后廢棄胎兒3例。胚胎/胎兒均為男性，胎齡6～14周。未發現兩種因子的6周減胎標本不納入研究。最終納入18例，將標本按胎齡(7周、8周、9周、10周、11～12周、13～14周)分為6組，每組3例。性腺的收集在術后24 h內完成。在體式顯微鏡下進行早期胚胎性腺組織的分離。胎齡6～20周，性腺高度平膀胱，位于其兩側，鏡下大小如黃豆狀，10周前可以看到未分化的條狀的中腎組織，可幫助辨別性腺組織。性腺組織取出后立即投入裝滿Bouins液的EP管中，-80 ℃保存。

1.2 主要試劑 羊抗人LIN28多克隆抗體(R&D公司)，兔抗人OCT4多克隆抗體(Abcam公司)，Alexa Fluor 555熒光二抗、Alexa Fluor 633熒光二抗(Invitrogen公司)，驢血清blocking液和SRY-box PCR試劑盒(Life Technologies公司)。

1.3 性別鑒定 利用PCR技術對新鮮收集的標本進行Y染色體性別決定區(sex determining region，SRY)基因檢測。使用已知老鼠雄性腎臟組織作陽性對照(人鼠SRY基因同源)，用成年女子心臟組織(Biochain公司)作陰性對照。鑒定方法參考文獻[11]。

1.4 睪丸組織中LIN28 和OCT4蛋白的檢測 采用免疫熒光技術。將所取睪丸組織用Bouins液固定，蔗糖脫水后制成冰凍切片并-80 ℃保存。切片取出后首先在檸檬酸中加熱修復(96 ℃10 min)，然后驢血清封閉(室溫1 h)，加入稀釋100倍的LIN28及OCT4一抗4 ℃孵育過夜，PBST洗滌3次，在暗室中加入稀釋100倍的熒光二抗室溫孵育50 min，再次PBST洗滌3次，加入細胞核著色劑DAPI(500倍稀釋，室溫，15 min)，洗滌同上，在蓋玻片上加入抗淬滅劑并在激光共聚焦顯微鏡下拍照。選取3張片子進行觀察，計數細胞[12]。陽性細胞百分數=陽性細胞數/PGCs數×100%。

1.5 統計學處理 采用SPSS 17.0進行統計學處理，組間LIN28和OCT4陽性細胞百分數的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 性別鑒定結果 以10周、11周兩組標本為例，電泳圖見圖1。可以看到，兩組標本的電泳圖與陽性對照一致，在250 bp處有單一明亮條帶，可以認為樣本均為男性胚胎/胎兒，所取性腺組織為睪丸組織。

圖1 SRY-PCR結果

2.2 LIN28和OCT4在PGCs中的亞細胞定位 標記蛋白OCT4在胚胎和早期胎兒發育過程中一直定位于PGCs胞核中。但LIN28的定位存在變化。在胎齡第7周(圖2A)時，LIN28表達于PGCs胞核內；在第8～9周(圖2B)時，PGCs胞核和胞質中均表達LIN28；而第10周以后，出現LIN28只在胞質中的PGCs(圖2C)；第11～14周時，LIN28均定位于PGCs胞質中(圖2D)。

2.3 PGCs中LIN28和OCT4蛋白表達水平的變化 見表1。胎齡第7～13周的胎兒睪丸組織中OCT4和LIN28蛋白表達結果顯示，隨著胎齡的增加，LIN28的表達逐漸增高，第13～14周時PGCs中LIN28陽性細胞百分數達到可見的最高峰32.580%；OCT4表達在胎齡第7周和11～12周出現兩個峰值，而在胎齡第13周后，OCT4陽性細胞就很少被觀測到。

圖2 LIN28在PGCs中亞細胞定位的變化

A：胎齡第7周；B：胎齡第8～9周；C：胎齡第10周；D：胎齡第11～14周。

表1 不同胎齡胚胎/胎兒睪丸組織中LIN28和OCT4蛋白表達的比較

組間兩兩比較，P均<0.05。

3 討論

3.1 PGCs早期發育過程中OCT4表達的變化 OCT4在維持胚胎干細胞的多能性和自我更新方面起關鍵作用[13]，其在孕早期性腺中特異性高表達。當早期PGCs到達生殖脊后，性索開始出現，這個時期相當于胎齡第7～9周，然后生殖細胞通過有絲分裂進行增殖。雌性生殖細胞在胎齡第10周時開始進行減數分裂， 而雄性生殖細胞直到青春期才開始這一過程。在雄性胎兒生殖細胞早期發育時期，細胞分裂為3個亞種群：生殖母細胞群、中間細胞群和前精原細胞群[14]。OCT4陽性細胞在形態學上為生殖母細胞群，這些細胞擁有圓的、規則的細胞核，核質比高。該研究結果顯示，在早期(胎齡第7～14周)胚胎發育過程中，標記蛋白OCT4一直定位于PGCs胞核中；OCT4表達在胎齡第8～9周時低于第7周，第10～12周時OCT4表達再次升高，而在第13周以后，OCT4表達就逐漸降低。提示OCT4是一個穩定的早期PGCs標記蛋白，這與其他學者[15]認為的OCT4作為一種早期PGCs標記并高度特異表達相一致。

3.2 PGCs早期發育過程中LIN28表達的變化 LIN28是一種在人胎兒睪丸發育過程中和成年人睪丸中表達的限定基因，是推測的生殖細胞標記因子[16]。該研究結果表明，從胎齡第7周開始直至第14周， PGCs中LIN28蛋白的表達逐漸增強，在胎齡第13～14周時達到最高峰。在定位上，在胎齡第7周時LIN28表達于PGCs胞核內；在胎齡第8～9周時，PGCs胞核和胞質中均可觀察到LIN28的表達；而胎齡第10周以后，出現部分LIN28僅表達于胞質中的PGCs；胎齡第11～14周時LIN28均定位于PGCs胞質中。據此推測，與早期因子OCT4比較，LIN28是一個表達時限稍長的PGCs發育早中期標記因子。LIN28蛋白含有保守的核定位序列PRKRK，推測LIN28先在細胞核中合成，發揮相關作用后，在生殖細胞發育過程的某個階段，其與出核載體蛋白結合，被轉運入細胞質。既往研究[17-18]發現LIN28可通過負向調控let-7 miRNA而促進PRDM1的表達，導致胚胎干細胞的分化和PGCs的形成及擴增。PGCs早期發育過程中LIN28表達模式的變化很可能跟相關信號傳導有關。

3.3 PGCs早期發育過程中LIN28與OCT4的相互作用 當細胞在一個時段同時表達兩個蛋白，可以認為這兩個蛋白在特定時期的特定細胞中共表達。在亞細胞水平，如果共表達的兩個對象在胞內分布有重疊稱為共定位，共定位至少為兩者可能存在的相互作用提供了一個必要條件。該研究結果顯示，在胚胎早期發育階段(胎齡第7周)，只有一小部分PGCs共表達LIN28和OCT4，隨著睪丸組織的發育，LIN28和OCT4共表達的PGCs比例逐漸增高，在胎齡第11～12周時共表達的PGCs比例達到100%。這提示LIN28和OCT4可能具有某些更深刻的相互關系來共同調控PGCs形成和發育。

綜上所述，作者認為，RNA結合蛋白LIN28是一個可行的、穩定的雄性PGCs標記因子，這為原始生殖細胞發育機制的研究提供了參考。

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(2014-10-18 收稿 責任編輯王 曼)

Expressions of LIN28 and OTC4 in male primordial germ cells

WANGYafen1)，FENGHanqi1)，WANGXingling1)，HUXulin2)，JIJiakui2)，GUANYichun1)，LILi1)，LIUFang1)

1)DepartmentofReproductiveMedicine,theThirdAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 2)CenterforStemCellandRegenerativeMedicine,CollegeofMedicalSciences，TsinghuaUniversity,Beijing100083

primordial germ cell; LIN28; OCT4; male

Aim: To explore the expression of LIN28 in the male primordial germ cells(PGCs). Methods: The male embryo/fetus were collected(gestational age of 7 weeks, 8 weeks, 9 weeks, 10 weeks, 11-12 weeks, 13-14 weeks was 3 cases,respectively) to obtain human fetal testicular tissue. Immunofluorescence technique was used to detect the expressions of LIN28 and OCT4 in PGCs. Results: There were significant differences in the expressions of LIN28 and OCT4 among the 6 groups(F=15.651,6.501，P<0.05).At the gestational age of 7-14 weeks,OCT4 was located in the nucleus of PGCs. The expression of OCT4 in PGCs at the gestational age of 8-9 weeks was lower than that at the gestational age of 7 weeks, and it increased at the gestational age of 10-12 weeks, decreased after the gestational age of 13 weeks. From the gestational age of 7 to 14 weeks, the expression of LIN28 in PGCs increased gradually, and reached to the peak at the gestational age of 13-14 weeks. At the gestational age of 7 weeks,LIN28 expressed within the nuclei of PGCs. At the gestational age of 8-9 weeks, LIN28 expressed within the nucleus and cytoplasm of PGCs, LIN28 only expressed in the cytoplasm in partial PGCs at gestational age of 10 weeks. At the gestational age of 11-14 weeks,LIN28 was positioned in the cytoplasm of PGCs. Conclusion: LIN28 may be a feasible and relatively stable male primordial germ cell marker.

10.13705/j.issn.1671-6825.2015.03.021

*河南省科技廳國際合作項目 124300510011

R714.1