KYBNZ-1I對Tca8113 細胞增殖的抑制作用

常 悅，王維嘉，樸軍顏，姚 珂，左非非，徐少博，徐 霞#

1)鄭州大學口腔醫學院正畸科 鄭州 450052 2)鄭州大學臨床醫學系 鄭州 450001 3)鄭州大學藥學院 鄭州 450001

KYBNZ-1I對Tca8113 細胞增殖的抑制作用

常 悅1)，王維嘉2)，樸軍顏3)，姚 珂3)，左非非3)，徐少博3)，徐 霞3)#

1)鄭州大學口腔醫學院正畸科 鄭州 450052 2)鄭州大學臨床醫學系 鄭州 450001 3)鄭州大學藥學院 鄭州 450001

#通信作者，女，1965年4月生，博士研究生，教授，研究方向：藥物代謝，E-mail：xuxia@zzu.edu.cn

KYBNZ-1I；Tca8113細胞；增殖；凋亡；細胞周期

目的：觀察冬凌草提取物KYBNZ-1I對口腔鱗狀細胞癌細胞Tca8113增殖的抑制作用，并探討其可能機制。方法：采用MTT法檢測0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mg/L的KYBNZ-1I分別作用24、48、72 h對Tca8113細胞增殖的抑制作用。分別采用流式細胞儀及Western blot檢測0.0、1.0、2.0、3.0 mg/L的KYBNZ-1I作用48 h Tca8113細胞的周期分布、凋亡情況及CyclinD1、CyclinB1、Cdc-2蛋白的表達。結果：KYBNZ-1I對Tca8113細胞增殖有抑制作用，該作用呈劑量和時間依賴性(F劑量=133.991，F時間=22.526，P<0.05)。與對照組比較，1.0、2.0、3.0 mg/L的KYBNZ-1I作用48 h后G2/M期細胞增多，并可誘導細胞凋亡，呈劑量依賴性(F=108.465、212.353，P<0.05)；隨藥物劑量的升高，CyclinD1蛋白的表達水平下降(F=45.288，P<0.001)，CyclinB1、Cdc-2蛋白的表達水平升高(F=21.273、19.228，P<0.05)。結論：KYBNZ-1I對Tca8113細胞增殖有抑制作用，可將細胞阻滯于G2/M期并誘導細胞凋亡，其作用機制可能與KYBNZ-1I抑制CyclinD1蛋白的表達、提高CyclinB1和Cdc-2蛋白的表達有關。

口腔癌是頭頸部較常見的惡性腫瘤，其中口腔鱗狀細胞癌占口腔惡性腫瘤的80%以上，并且呈逐年增加的趨勢[1]。近年來癌癥的治療獲得了較大的進步和發展，但死亡率仍呈上升趨勢。口腔鱗狀細胞癌的治療一般以手術治療為主，放療、化療、免疫治療和中醫藥治療為輔。手術治療屬于損傷性治療，而放療和化療不僅殺傷腫瘤細胞，對正常細胞也有破壞作用。目前傳統的口腔鱗狀細胞癌化療藥物如順鉑、環磷酰胺、5-氟尿嘧啶等不良反應重、耐藥廣泛，而且療效不太穩定。因此，人們正在尋找既能使化療藥物發揮最大限度的殺傷作用又不損傷正常細胞的藥物[2-3]。冬凌草學名碎米椏，別名冰凌草，是一種多年生草本植物,主要產地為河南濟源太行山、王屋山一帶[4]。相關研究[5]表明冬凌草有抗腫瘤作用。KYBNZ-1I是新研制的一種冬凌草提取物的衍生物。作者觀察了KYBNZ-1I對口腔鱗狀細胞癌細胞株Tca8113的抑制作用，探討其遠期用于口腔鱗狀細胞癌治療的可能性與安全性，以期為口腔鱗狀細胞癌的治療帶來新的契機。

1 材料與方法

1.1 細胞株、主要試劑及儀器 Tca8113 細胞株(Type Culture Collection，美國)；KYBNZ-1I(鄭州大學藥學院)，胎牛血清(FBS)(北京索來寶有限公司)，胰蛋白酶、四甲基偶氮唑藍(MTT)(美國Sigma公司)，兔抗人細胞周期蛋白(Cyclin)D1、CyclinB1、Cdc-2、β-actin多克隆抗體(美國Santa Cruz公司)，PBS粉末(鄭州創生生物工程有限公司)，Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物科技發展有限公司)；CO2培養箱(E191)(美國SIM公司)，超低溫冰箱(-80 ℃)(美國Thermo公司)，高速冷凍離心機(Z323K)(德國HERMLE公司)，96孔板(美國Corning Costar公司)，臺式離心機(TGL-16G)(上海安亭科學儀器廠)，蛋白電泳轉印儀、化學發光成像系統(美國Bio-Rad公司)，流式細胞儀(美國BD公司)。

1.2 細胞培養 將Tca8113細胞培養于含體積分數10%胎牛血清的RPMI 1640培養液中,置37 ℃、濕度100%、體積分數5%CO2的培養箱內進行傳代培養，每 1～2 d換液 1 次。

1.3 不同劑量KYBNZ-1I處理后細胞增殖抑制率的測定 取對數生長期的Tca8113細胞，調整細胞密度為 5×104mL-1，接種于96孔板, 每孔200 μL。待細胞貼壁后分別加入終質量濃度為0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mg/L的KYBNZ-1I溶液，設5個平行復孔，然后將培養板置于37 ℃恒溫培養箱中進行常規培養。分別于藥物作用24、48、72 h后，加入5 g/L MTT溶液20 μL，繼續培養4 h，棄去培養液，每孔加入100 μL DMSO，振蕩10 min使結晶充分溶解，酶標儀測定570 nm波長處的OD值，細胞增殖抑制率(%)=(1-實驗組OD值/對照組OD值)×100%。采用改良寇氏法計算IC50。實驗重復3次。

1.4 不同劑量KYBNZ-1I處理后細胞周期的檢測

取對數生長期的Tca8113細胞，以終質量濃度為1.0、2.0、3.0 mg/L的KYBNZ-1I溶液和溶劑處理48 h；PBS洗滌2次，收集細胞，用體積分數為70%的冷乙醇固定，4 ℃保存過夜；棄去乙醇，再次懸浮細胞于PBS，溴化丙啶染色5 min，4 ℃避光30 min，流式細胞儀檢測細胞周期，得出細胞周期分布圖。實驗重復3次。

1.5 不同劑量KYBNZ-1I處理后細胞凋亡的檢測

Tca8113細胞同1.4中分組、處理48 h后，用胰蛋白酶消化，收集106個細胞, PBS洗滌后加入500 mL的Binding Buffer懸浮細胞，每管加入 2 μL Annexin Ⅴ-FITC、2 μL PI雙染，室溫避光反應10 min，用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。實驗重復3次。

1.7 統計學處理 采用SPSS 17.0處理數據。采用5×3析因設計的方差分析觀察不同劑量KYBNZ-1I分別作用24、48和72 h對細胞增殖抑制率的影響，采用單因素方差分析比較各組細胞周期分布、凋亡率及CyclinD1、CyclinB1、Cdc-2蛋白表達水平的差異，兩兩比較采用Bonferroni法，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 不同劑量KYBNZ-1I對Tca8113細胞增殖的影響 見表1。KYBNZ-1I處理Tca8113細胞24、48和72 h的IC50分別為5.137、4.254和6.384 mg/L。

表1 不同劑量KYBNZ-1I處理后Tca8113細胞的增殖抑制率 %

F時間=22.526，F劑量=133.991，F交互=8.083，P均<0.001。

2.2 不同劑量KYBNZ-1I對Tca8113細胞周期的影響 不同劑量的KYBNZ-1I作用48 h后, G0/G1期的Tca8113細胞減少，而G2/M期的Tca8113細胞增多。見表2。

表2 不同劑量KYBNZ-1I對Tca8113細胞周期的影響 %

*:與0.0 mg/L組相比，P<0.05。

2.3 不同劑量KYBNZ-1I對Tca8113 細胞凋亡的影響 流式細胞術結果顯示KYBNZ-1I可以促進Tca8113 細胞凋亡，細胞凋亡率隨給藥劑量的增大呈上升的趨勢(表3)，且晚期凋亡細胞增加尤為明顯。

2.4 不同劑量KYBNZ-1I對Tca8113 細胞CyclinD1、CyclinB1、Cdc-2蛋白表達水平的影響 隨著藥物劑量的增加，CyclinD1蛋白的表達水平逐漸下降，而CyclinB1、Cdc-2蛋白的表達水平逐漸升高，見表3。

表3 不同劑量KYBNZ-1I對Tca8113細胞3種蛋白表達水平及細胞凋亡的影響

3 討論

口腔鱗狀細胞癌是口腔系統高發的惡性腫瘤之一，該類患者臨床上生存率較低， 且預后也較差。腫瘤的發生與細胞增殖及凋亡失衡有關，通過誘導腫瘤細胞凋亡來消除腫瘤已成為治療腫瘤的有效途徑。冬凌草衍生物已被證實不僅具有抗腫瘤作用,還具有毒性低的特點[6]。 KYBNZ-1I是新研制的一種冬凌草衍生物。該研究顯示KYBNZ-1I對Tca8113細胞增殖的抑制作用隨藥物劑量的增大呈增強的趨勢，8.0 mg/L KYBNZ-1I作用72 h后，其增殖抑制率高達93.832%，產生此作用的原因可能是KYBNZ-1I對Tca8113細胞產生了增殖抑制和分化誘導作用。流式細胞術結果顯示KYBNZ-1I作用后，G0/G1期細胞比例降低，G2/M 期細胞比例增加，說明KYBNZ-1I可將細胞周期阻滯于G2/M期，可能通過促進Tca8113 細胞DNA合成，阻止其分裂，從而抑制癌細胞的增殖活性；同時，細胞凋亡率也隨藥物劑量的增大而升高，說明KYBNZ-1I可能通過誘導癌細胞凋亡從而抑制腫瘤的生長。

細胞周期的調控在細胞增殖、分化、凋亡過程中發揮著重要作用。細胞周期調節依賴Cyclin、周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinase,CDK)以及相關調節機制。細胞周期中G1/S期轉換受到G1期Cyclin、CDK和CDK抑制劑的調節。細胞周期調控機制異常與細胞異常增殖及惡性腫瘤的發生關系密切。人體細胞周期不同時相都存在關鍵的調控點，正常情況下CyclinD1結合并激活G1期特有的 CDK4，使Rb蛋白磷酸化，從而釋放出轉錄因子 E2F，E2F 起始轉錄并激活細胞周期的相關基因，促使細胞由G1期進入S期[7]。國內相關研究[8]證實CyclinD1和CDK4在正常口腔黏膜上皮組織呈低水平表達，在口腔鱗狀細胞癌組織中過表達，說明CyclinD1在惡性腫瘤的形成過程中起著十分重要的作用。該研究中以1.0、2.0、3.0 mg/L的KYBNZ-1I作用于Tca8113細胞48 h，結果顯示細胞CyclinD1蛋白的表達隨著藥物劑量增加而降低，推測KYBNZ-1I可能阻止Tca8113細胞由DNA合成前期向DNA合成期轉化，從而抑制腫瘤細胞增殖。

在細胞有絲分裂前，CyclinB1在細胞內累積， CyclinB1結合Cdc-2形成CyclinB1-Cdc-2復合物，抑制Thr14和Tyr15磷酸化，Thr14和Tyr15磷酸化對有絲分裂起抑制作用[9]。有研究[10]表明CyclinB1一般在有絲分裂前期或中期積累，后期開始減少，在有絲分裂開始時進入細胞核，從而促進整個細胞周期過程。一般而言細胞阻滯于G2期，CyclinB1和Cdc-2活性減弱。該研究中KYBNZ-1I將Tca8113細胞阻滯于G2/M期，而CyclinB1和Cdc-2蛋白的表達水平均隨著藥物劑量的增加而升高, 機制不詳，亦有學者[10]得出與該研究相似的研究結果，具體機制有待進一步研究。

綜上所述，KYBNZ-1I對Tca8113細胞增殖有抑制作用,可將細胞阻滯于G2/M期，并可誘導細胞凋亡，其作用機制可能與KYBNZ-1I抑制CyclinD1蛋白的表達、升高CyclinB1和Cdc-2蛋白的表達有關。KYBNZ-1I的發現有望為口腔鱗狀細胞癌的治療提供新的藥物。

[1]張超賢,郭李柯,史淑敏.飲酒和細胞外超氧化物岐化酶、乙醛脫氫酶2基因多態性與口腔鱗狀細胞癌的相關性研究[J].華西口腔醫學雜志,2014,32(2):119

[2]張逸凡,關忠民,陳笑艷,等.抗腫瘤新藥埃克替尼在動物體內的藥動學和組織分布研究[J].中國新藥雜志,2014,23(2):235

[3]Tan F,Shen X,Wang D,et al.Icotinib(BPI-2009H), a novel EGFR tyrosine kinase inhibitor, displays potent efficacy in preclinical studies[J].Lung Cancer,2012,76(2):177

[4]Liu Z,Ouyang L,Peng H,et al.Oridonin:targeting programmed cell death pathways as an anti-tumour agent[J].Cell Prolif,2012,45(6):499

[5]尹波,李志偉,張弩，等.冬凌草甲素對C6大鼠腦膠質瘤裸鼠異種移植模型的抗腫瘤療效研究[J].腫瘤學雜志,2014,20(1):34

[6]王紹豐,盧啟立.冬凌草的現代研究概況[J].廣州醫藥，2008,39(1):46

[7]黃濤，張令達.口腔鱗狀細胞癌組織中p57kip2和Cyclin D1 mRNA的表達及意義[J].安徽醫科大學學報,2013,48(4):398

[8]Yunlan L,Juan Z,Qingshan L.Antitumor activity of di-n-butyl-(2,6-difluorobenzohydroxamato)tin(Ⅳ) against human gastric carcinoma SGC-7901 cells via G2/M cell cycle arrest and cell apoptosis[J].PLoS One,2014,9(3):e90793

[9]Hunter T,Pines J.Cyclins and cancer.Ⅱ:Cyclin D and CDK inhibitors come of age[J].Cell,1994,79(4):573

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(2014-09-30 收稿 責任編輯徐春燕)

Inhibitive effect of KYBNZ-1I on proliferation of Tca8113 cells

CHANGYue1)，WANGWeijia2)，PIAOJunyan3)，YAOKe3)，ZUOFeifei3)，XUShaobo3)，XUXia3)

1)DepartmemtofOrthodontics,CollegeofStomatology,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 2)DepartmentofClinicalMedicine,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001 3)CollegeofPharmaceuticalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001

KYBNZ-1I;Tca8113 cell;proliferation;apoptosis;cell cycle

Aim: To investigate the effect of KYBNZ-1I on proliferation of oral squamous cell carcinoma cell line Tca8113 and the possible mechanism.Methods: The effect of KYBNZ-1I(0.5,1.0,2.0,4.0 and 8.0 mg/L) on proliferation of Tca8113 cells for 24,48 and 72 h was measured by MTT assay. Tca8113 cells were treated by 0.0,1.0,2.0 and 3.0 mg/L KYBNZ-1I for 48 h, then flow cytometry and Western blot were used to detect the cell cycle distribution, apoptosis and the expressions of CyclinD1,CyclinB1 and Cdc-2.Results: KYBNZ-1I inhibited the proliferation of Tca8113 cells in a time and dose dependent manner(Fdose=133.991，Ftime=22.526，P<0.05). Compared with control group, the percentage of G2/M phase Tca8113 cells was significantly higher(F=108.465，P<0.001),and cell apoptosis rate raised(F=212.353，P<0.001) in a dose-dependent manner. With the increase of KYBNZ-1I concentration, the expression of CyclinD1 decreased(F=45.288，P<0.001),and the expressions of CyclinB1 and Cdc-2 increased(F=21.273 and 19.228，P<0.05).Conclusion: KYBNZ-1I could inhibit proliferation, arrest the cells at G2/M phase and induce cell apoptosis, which may be explained by its restraining expression of CyclinD1, and upregulating expressions of CyclinB1 and Cdc-2.

10.13705/j.issn.1671-6825.2015.03.028

R780.2