普通煙草SBP轉錄因子家族的全基因組鑒定及其進化和表達分析

劉 成，李曉旭，蘇玉龍，郭永峰

（1.中國農業科學院煙草研究所，青島 266101；2.中國農業科學院研究生院，北京 100081）

普通煙草SBP轉錄因子家族的全基因組鑒定及其進化和表達分析

劉 成1，2，李曉旭1，2，蘇玉龍1，2，郭永峰1*

（1.中國農業科學院煙草研究所，青島 266101；2.中國農業科學院研究生院，北京 100081）

SBP轉錄因子家族作為植物特異性的轉錄因子具有重要的生物學功能，廣泛參與花和果實發育等諸多生命過程。利用普通煙草（Nicotiana tabacum）TN90基因組數據，通過隱馬爾科夫模型檢索，SMART和Pfam分析，鑒定了普通煙草SBP轉錄因子家族成員；通過多序列比對鑒定并分析了普通煙草SBP結構域的結構特征；通過鄰接法、極大似然法進行了系統發育分析；分別利用GSDS和MEME對SBP轉錄因子家族成員的基因結構和蛋白保守結構域進行了分析；利用普通煙草TN90轉錄組數據分析了SBP轉錄因子家族成員在不同組織和時期的表達情況，并對鑒定出的SBP轉錄因子家族成員進行了GO注釋分析。結果表明，普通煙草基因組編碼32個SBP轉錄因子家族成員，氨基酸序列長度差異較大；系統發育分析表明，所有的SBP轉錄因子家族成員可分為8個亞家族。轉錄組數據顯示，SBP基因家族成員在不同組織和時期中表達迥異，但在花器官中均有較高的表達量。GO注釋結果表明，該家族成員作為轉錄因子，在植物的生長發育、逆境響應等過程中發揮作用。本研究為煙草及其他植物中SBP轉錄因子家族基因的鑒定和功能研究提供了基礎。

生物信息學分析；SBP轉錄因子家族；普通煙草

轉錄因子是參與轉錄調控的一類蛋白，通過與特定序列的DNA結合，能夠激活或抑制目標基因的轉錄，從而調控基因的表達［1］。SQUAMOSA Promoter Binding Proteins（SBPs）轉錄因子家族是一類植物特有的重要轉錄因子，由多個成員組成，最早發現于金魚草中，廣泛參與植物生長、發育以及多種生理生化過程［2］。SPL（SBP-like）基因主要調控花和果實發育，有報道稱擬南芥中SPL3，SPL8，SPL14在開花、孢子形成、赤霉素信號傳導、抵抗毒素侵襲等生命過程中發揮著重要作用［3-6］。作為植物特異的轉錄因子，所有已知的SBP轉錄因子家族成員蛋白中均含有一段由79個氨基酸殘基組成的高度保守的DNA結合域。擬南芥SBP轉錄因子的DNA結合域由兩個分離的鋅指結構組成，一個是C3H或C4，另一個是C2HC［7］。根據文獻報道，SBP轉錄因子家族很多成員都受到miR156的調控。目前在擬南芥和水稻中都各發現有11個SPL基因含有miR156的識別位點［8］，擬南芥營養發育過程中SPL3的時空性表達受到miR156的調控［9］，水稻中的miR156和某些OsSPL基因也會發生組織特異性互作［10］。隨著越來越多的植物基因組測序的完成，SBP轉錄因子家族在全基因組范圍內已經被廣泛地鑒定。

煙草是重要的經濟作物，同時也是一種重要的模式植物，經常作為分子生物學的研究對象。在普通煙草基因組注釋信息公布前，人們往往采取同源克隆結合RACE技術等手段研究煙草中重要的功能基因，如陸瑩等［11］利用馬鈴薯的同源基因在煙草中克隆到了光周期的關鍵基因NtCO1并進行了初步分析；劉好寶等［12］在煙草中同源克隆到4個鉀離子通道基因：NKT3、NKT4、NKT5和NKT6。隨著生物信息學的發展和煙草基因組測序、注釋的完成，煙草中如鈣依賴蛋白激酶基因家族（CDPK Gene Family）［13］等基因家族都已成為研究的熱點。但煙草中針對SBP轉錄因子家族的研究還未見報道。本研究在普通煙草的全基因組注釋信息的基礎上，利用生物信息學方法鑒定出普通煙草32個SBP轉錄因子家族成員，分析了各成員的進化關系、基因結構、蛋白保守結構域、表達情況，并進行GO注釋分析，為進一步研究普通煙草SBP轉錄因子家族成員的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 普通煙草SBP轉錄因子家族成員的鑒定與序列分析

根據文獻報道，在TAIR數據庫（http://www. arabidopsis.org/）下載了擬南芥SBP轉錄因子家族成員的蛋白全長序列，在PlantTFDB（http:/ /planttfdb.cbi.pku.edu.cn/）數據庫［14］下載了番茄、馬鈴薯的SBP轉錄因子家族成員的蛋白全長序列。對于擬南芥、番茄、馬鈴薯的SBP蛋白全長序列，利用MAFFT分別進行序列比對，使用HMMER 3.0分別建立隱馬爾科夫模型序列譜（profile hidden Markov models，profile HMMs）。在茄科植物數據庫（http://solgenomics.net/）下載普通煙草TN90蛋白序列數據庫，分別使用建立的3個隱馬爾科夫模型序列譜對普通煙草TN90蛋白序列數據庫進行檢索，選取E值為0.01，手工去除冗余序列，得到候選序列。最后針對所獲得的候選序列，利用SMART和Pfam分析蛋白結構，剔除不含完整SBP結構域的蛋白序列。利用ExPASy Proteomics Server（http://expasy.org/）對所有SPB家族成員蛋白氨基酸序列進行分子量、等電點預測分析。

1.2 多序列比對和系統發育分析

將擬南芥和普通煙草TN90的SBP蛋白全長序列用MAFFT［15］在默認參數下進行多序列比對。選取保守的SBP結構域，利用Texshade將結果可視化。利用擬南芥、普通煙草SBP結構域蛋白序列的比對結果，使用MGEA5構建鄰接樹（Neighbor-Joining， NJ tree），參數設置為：Bootstrap檢驗次數設為1000次，并選擇Poisson Model 和Pairwise Deletion進行分析。利用同樣的比對結果，使用PhyML構建極大似然樹［16］（Maxumum Likeihood， ML tree）。Bootstrap設為100次，并利用ProtTest 2.4［17］對擬南芥和普通煙草SBP結構域氨基酸序列比對結果進行分析，選擇LG+G模型構建極大似然樹，并利用Tree View 1.4.0顯示系統發生樹。

1.3 基因結構和結構域分析

在茄科植物數據庫（http://solgenomics.net/），下載普通煙草TN90基因組信息，通過Perl程序分析并提取SBP基因家族成員的基因結構信息，使用GSDS（http://gsds.cbi. pku.edu.cn/）工具對分析結果進行基因結構的可視化展示。利用Multiple Expectation Maximization for Motif Elicitation（MEME， http://meme.nbcr.net/meme/cgi-bin/mem e.cgi）［18］對SBP轉錄因子家族成員的蛋白序列基序（motif）進行分析。

1.4 普通煙草SBP轉錄因子家族基因表達分析及GO注釋分析

在NCBI SRA（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra）數據庫檢索并下載TN90轉錄組測序（RNA-seq）數據，提取表達數據，利用R語言對轉錄組表達數據進行分析并提取SBP基因家族成員的基因表達數據，將表達數據標準化后，使用R語言pheatmap程序繪制熱圖（heatmap），將表達數據可視化。使用普通煙草SBP轉錄因子家族蛋白序列，利用Blast2GO進行GO（Gene Ontology， GO）注釋［19］，WEGO工具［20］分析注釋結果并進行可視化展示。

2 結 果

2.1 普通煙草SBP轉錄因子家族成員鑒定及理化特征分析

利用文獻報道的擬南芥SBP轉錄因子家族成員蛋白序列以及PlantTFDB中番茄和馬鈴薯的SBP轉錄因子家族成員蛋白序列，分別構建了隱馬爾可夫模型序列譜。利用構建的3個隱馬爾科夫模型序列譜分別檢索普通煙草TN90蛋白數據庫，綜合3個檢索結果，人工去除冗余序列，獲得候選蛋白序列。通過SMART和Pfam對候選蛋白序列進行結構域分析，剔除不含完整SBP功能域的蛋白序列，最終預測得到32個煙草SBP基因家族成員，命名為NtSPL1-NtSPL32（表1）。

表1 普通煙草SBP轉錄因子家族成員特征Table 1 Characteristics of SBP transcription factor family in N. tabacum

對普通煙草SBP轉錄因子家族成員進行蛋白質序列及理化性質分析發現，這些氨基酸的長度變化差異較大，在133～999 aa，蛋白分子量則介于15.27～110.97 kD。家族成員蛋白的理論等電點變化較小，在5.15～9.76，其中第I-V亞族（7.64～9.43）理論等電點都在堿性范圍內，表明這些亞家族蛋白富含堿性氨基酸，而第VIII亞族（NtSPL6和NtSPL32）理論等電點較低（5.15～5.29），其蛋白含有較多的酸性氨基酸。所有SBP轉錄因子家族蛋白疏水性均為負值，表明此家族均屬于親水性蛋白，其中第Ⅶ亞族蛋白疏水性普遍較低，從-1.313到-1.084，說明第VII亞族蛋白均具有較強的親水性。

2.2 普通煙草SBP結構域的鑒定和分析

圖1 擬南芥、普通煙草SBP轉錄因子家族蛋白SBP結構域分析Fig. 1 Conserved SBP domain analysis of SBP family proteins in N. tabacum and A. thaliana

將文獻報道的16條擬南芥SBP轉錄因子家族成員蛋白序列和預測的32條普通煙草SBP轉錄因子家族成員蛋白序列，使用MAFFT在默認參數下進行多序列比對，發現所有序列均含保守的SBP結構域。選取保守的SBP結構域，利用Texshade將結果可視化（圖1），擬南芥和普通煙草的SBP結構域高度相似，均含79個氨基酸殘基。利用核磁共振方法，擬南芥中兩個SBP結構域的三維溶液構象已經被報道［21］，兩者都含2個鋅指結構（Zinc finger）。AtSPL3的N端鋅指結構（Zn-1）為Cys3His（C3H），C端鋅指結構（Zn-2）為Cys2HisCys（C2HC）。AtSPL7的N端鋅指結構為Cys4（C4），C端鋅指結構與同樣為C2HC。經過對擬南芥和普通煙草SBP結構域的分析，發現所有的AtSPL和NtSPL轉錄因子均包含兩個鋅指結構：AtSPL7、NtSPL6和NtSPL32的N段鋅指結構為C4，其余成員的N端鋅指結構均為C3H；所有的C端鋅指結構均為C2HC。與擬南芥類似，普通煙草SBP轉錄因子家族成員蛋白SBP結構域C端存在由大量的堿性氨基酸殘基組成的高度保守的核定位信號（nuclear localization signal， NLS）［21］。

2.3 擬南芥和普通煙草SBP轉錄因子家族的系統發育分析

為了揭示普通煙草SBP轉錄因子家族的進化關系，參照Guo等［2］的方法，使用擬南芥和普通煙草SBP轉錄因子家族成員SPB結構域氨基酸序列，利用MEGA和PhyML分別構建了鄰接樹（圖2）和極大似然樹（圖3），兩者具有高度相似的拓撲結構。構建的鄰接樹顯示，擬南芥和普通煙草SBP轉錄因子家族成員被分為8個亞家族每一個亞家族都包含了兩個物種中至少一個的SBP轉錄因子家族成員，這說明了SBP轉錄因子家族成員的分化時間可能早于兩個物種的分化時間。其中亞家族I-VIII含有擬南芥SBP轉錄因子家族成員的個數分別為：1、2、2、3、1、3、3和1；含有普通煙草SBP轉錄因子家族成員的個數分別為：7、2、2、4、3、4、8和2。普通煙草SBP轉錄因子家族成員的數量約為擬南芥的兩倍，但是擬南芥和普通煙草在不同亞家族中SBP轉錄因子家族成員的倍數關系差異較大，這說明在擬南芥和普通煙草分化后，SBP各個亞家族可能發生了不同的進化事件。此外，在亞家族I中普通煙草有7個SBP轉錄因子家族成員，而擬南芥只有一個SBP轉錄因子家族成員位于該分支中，說明在普通煙草物種形成后，該亞家族內SBP轉錄因子家族成員可能經歷了多次復制事件。在8個亞家族中，亞家族VIII與其他亞家族的親緣關系較遠，形成一個較為獨立的分支，這與以前的報道是一致的［22］。進一步分析發現，亞家族8中3個成員AtSPL7、NtSPL6和NtSPL32在SBP結構域中的N段鋅指結構為C4，而其他亞家族所有成員的N端鋅指結構均為C3H。

圖2 普通煙草、擬南芥SBP轉錄因子家族成員鄰接系統發育樹Fig. 2 Neighbor-joining phylogenetic tree of SBP family in N. tabacum and A. thaliana

2.4 擬南芥和普通煙草SBP基因家族的基因結構分析

圖3 擬南芥、番茄SBP轉錄因子家族極大似然系統發育樹及基因結構Fig. 3 The Maximum-Likelihood phylogenetic tree and gene structure of SBP family members in N. tabacum and A. thaliana

為了分析普通煙草SBP基因的結構特征，利用GSDS構建了擬南芥和普通煙草SBP基因家族成員的基因結構圖（圖3）。內含子-外顯子結構圖表明，不同亞家族的SPL基因之間內含子數目變異比較大，最多的有9個內含子，最少的有1個內含子。在亞家族I、II、III和V中，大部分成員含有2個內含子；亞家族IV中，大部分成員含有3個內含子；亞家族VII中，大部分成員含有1個內含子；亞家族VI和VIII中，大部分成員含有9個內含子。同一亞家族內，擬南芥與普通煙草直系同源的SPL基因，其外顯子、內含子的組織結構高度相似并區別于其他亞家族內的SPL基因，這同樣說明了SBP基因家族成員的分化時間可能要早于擬南芥和普通煙草的物種分化時間。進一步分析發現，同一亞家族內，擬南芥和普通煙草的旁系同源SPL基因的內含子的組織結構也相對一致，這也從側面反映了系統發育分析的可靠性。

2.5 擬南芥和普通煙草SBP轉錄因子家族的蛋白保守結構域分析

利用序列保守結構域識別工具MEME，對擬南芥SBP轉錄因子和預測的普通煙草SBP轉錄因子的蛋白序列的保守結構域進行分析（圖4）。分析結果表明，所有的擬南芥和普通煙草SBP轉錄因子家族成員均含有79個氨基酸殘基組成的SBP結構域（Motif 1）。除了SBP結構域，如Motif 2等一些新的保守結構域被鑒定出來，同一亞家族內的SBP轉錄因子家族成員的保守結構域的種類、數目和組織形式具有很強的一致性，同樣從側面反映了系統發育分析的可靠性。在亞家族VII內，擬南芥和普通煙草的SBP轉錄因子家族成員除了SBP結構域外沒有其他的保守結構域，而亞家族VI內存在Motif2、Motif3、Motif5和Motif7等其他亞家族中沒有或不典型的保守結構域，這說明亞家族VI的成員可能具有其他亞家族成員所不具有的功能。此外，亞家族I、II、III和IV中擬南芥有8個成員、普通煙草有13個成員有一個位于Motif 8中的保守基序ALSLLS，據文獻報道，其對應的mRNA序列可能是mRNA156的靶序列［8］。

2.6 普通煙草SBP基因家族的基因表達分析

使用TN90轉錄組測序（RNA-seq）數據進行分析并提取SBP基因家族成員的基因表達數據，使用R語言將表達數據可視化。從圖5中可以看出，SBP基因家族成員在根、莖、幼葉、成熟葉、衰老葉、幼花等6個組織中均有表達。進一步的分析發現，NtSPL基因的表達具有一定的組織特異性。所有NtSPL基因在幼花中都有表達，而且絕大多數成員還具有較高的表達量，這與擬南芥AtSPL基因在花中高度表達的報道相一致，表明SPL基因在植物的花發育中起重要作用［23］。進一步的分析發現在根、成熟葉、老葉等組織中，有些NtSPL基因表達量很低，如根中的第VII亞家族基因，成熟葉和老葉中的第I、III、V亞家族基因表達量普遍較低。同一亞家族的NtSPL基因在同一組織中的表達具有差異，成員較多的亞家族如第Ⅰ、第Ⅶ亞家族，在同一組織如莖、衰老葉中表達差異較大。同一亞家族的NtSPL基因在不同組織中的表達差異較為明顯，只有第Ⅵ亞家族的NtSPL基因在所檢測的6個組織中都有較高的表達量。此外，有些NtSPL基因隨著組織的發育而呈規律性的表達，如NtSPL2隨著葉片的衰老表達量逐漸升高，NtSPL10在衰老葉中表達量顯著增加，初步推測它們可能與植物的衰老進程相關。

2.7 普通煙草SBP轉錄因子家族GO注釋分析

通過對普通煙草SBP蛋白序列進行GO注釋發現，經鑒定普通煙草SBP轉錄因子家族成員的細胞組成（Cellular Component）、分子功能（Molecular Function）和所參與的生物學過程（Biological Process）與擬南芥SBP轉錄因子家族成員相似。GO注釋分析結果（圖6）表明，擬南芥和普通煙草的SBP蛋白均在細胞核中，發揮DNA結合和轉錄調節相關的功能，這與SBP轉錄因子家族成員作為轉錄因子的功能相一致。在細胞生物學過程方面，SBP轉錄因子家族成員的注釋呈多樣化。所有的擬南芥和普通煙草SBP蛋白

被注釋為參與到花器官發育，這與SBP成員在花器官中有較高的表達量是相吻合的。大部分蛋白還參與到葉片、莖和花粉管等植物器官的生長發育過程中，一些蛋白參與植物的防御響應等過程中，這與已有的文獻報道是相符的［2］。

圖4 擬南芥、番茄SBP轉錄因子家族蛋白保守結構域分析Fig. 4 Conserved domains within different subgroups of SBP family members in N. tabacum and A. thaliana

圖5 普通煙草SBP基因家族成員表達模式分析Fig. 5 Expression patterns of the SBP gene family members in N. tabacum

圖6 擬南芥、普通煙草SBP蛋白GO注釋Fig. 6 Gene ontology analysis of SBP proteins in N. tabacum and A. thaliana

3 討 論

SBP基因家族所編碼的具有植物特異性的轉錄因子具有許多重要的生物學功能，廣泛參與植物生長發育調節、逆境脅迫響應及孢子、花和果實發育等諸多生命過程。本研究采用生物信息學手段，首次從普通煙草基因組中，鑒定出32個SBP轉錄因子家族成員，所有成員均含有保守的SBP結構域。通過對SBP結構域進行分析發現，所有的NtSPL均具有兩個典型的鋅指結構和一個位于C端的保守核定位信號。針對擬南芥和普通煙草SBP轉錄因子家族成員的蛋白序列，通過鄰接法和極大似然法構建的系統發育樹具有高度相似的拓撲結構。系統發育分析表明擬南芥和普通煙草的SBP轉錄因子家族成員被分成了8個亞家族，每一個亞家族都包含了至少一個擬南芥和普通煙草SBP轉錄因子家族成員，說明SBP轉錄因子家族成員的分化形成可能早于擬南芥和普通煙草的分化時間。通過對擬南芥和普通煙草SBP基因的結構特征分析發現，不同亞家族中擬南芥和普通煙草的SPL基因之間內含子數目變異較大。然而，通過比較擬南芥與普通煙草的直系同源SPL基因，發現其外顯子、內含子的組織結構高度相似，這同樣印證了SBP基因家族成員的分化形成時間可能要早于擬南芥和普通煙草的物種分化時間。通過對SBP轉錄因子家族成員結構域的分析發現，相較其他亞家族而言，亞家族VI內存在許多較為復雜的保守結構域。此外，普通煙草中有13個成員存在一個位于C端的保守基序ALSLLS，其對應的mRNA序列可能是mRNA156的靶序列。SBP基因家族表達分析發現，NtSPLs基因的表達具有一定的組織特異性，所有NtSPL基因在幼花中都有表達，而且絕大多數成員還具有較高的表達量。GO注釋表明，普通煙草SBP轉錄因子家族成員注釋為參與到花器官發育，這與煙草SBP基因家族成員在花器官中有較高的表達量是相吻合的。大部分SBP轉錄因子家族成員被注釋為參與到葉片、莖和花粉管等植物器官的生長發育過程中，一些成員被注釋為參與植物的防御響應等過程中，但具體功能有待于利用分子生物學等手段進行進一步的基因功能驗證。

4 結 論

本研究利用普通煙草TN90基因組數據，通過生物信息學方法鑒定了普通煙草基因組編碼的32個SBP轉錄因子家族成員，并將這些成員分為8個亞家族。通過分析轉錄組數據，發現SBP基因家族成員在花器官中的表達水平較高。GO注釋結果表明，SBP家族在植物的器官發育、逆境防御等生物過程中發揮重要作用。

本研究通過生物信息學手段對SBP轉錄因子家族進行了鑒定和一些功能預測，但其具體的生物學功能以及調控機制，還需要通過基因克隆、表達分析及轉基因等實驗進行分析驗證。

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Genome-Wide Identification， Phylogenetic Analysis and Expression Profiling of the SBP Transcription Factor Family in Nicotiana tabacum

LIU Cheng1，2， LI Xiaoxu1，2， SU Yulong1，2， GUO Yongfeng1*
（1. Tobacco Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences， Qingdao 266101， China； 2. Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100081， China）

The members of the SBP transcription factor family have been reported to play significant roles in regulating flower and fruit development as well as other biological processes. In this study， 32 SBP transcription factor family members were identified in Nicotiana tabacum with HMMER. Both Maximum-Likelihood phylogenetic tree and neighbor-joining tree were constructed and were found to possess similar topologies using the protein sequences of the SBP-domain. Results of phylogenetic analysis revealed that the SBP transcription factor family members could be classified into 8 subfamilies. The patterns of exon-intron structure and conserved domains in Arabidopsis and tobacco were consistent with the phylogenetic results. Transcriptome analysis showed that the expression patterns of NtSPLs were different in different tissue types and the expression level of NtSPLs in flower was found to be significantly higher than the other tissues. GO analysis suggested that as transcription factors， the SBP family members could be involved in a series of biological processes such as developmental regulation and defense response. The results of this study provide insight into the evolution of the SBP transcription factor family in Nicotiana tabacum and provide useful information for future research on these genes.

bioinformatics analysis； SBP transcription factor family； Nicotiana tabacum

S572.01

1007-5119（2015）04-0001-11

10.13496/j.issn.1007-5119.2015.04.001

農業部948項目“高通量植物衰老基因克隆技術（TASSEL-tagging系統）的引進、創新及利用”（2013-Z4）

劉 成（1988-），男，碩士研究生，研究方向為煙草分子育種。E-mail：liuch1221@163.com。*通信作者，E-mail：guoyongfeng@caas.cn

2015-03-20

2015-07-20