不同生態區域烤煙煙葉香氣物質分析

李玲燕，徐宜民，劉百戰，王程棟，畢艷玖，劉曉冰，2，楊 凡，王樹聲

（1.中國農業科學院煙草研究所，農業部煙草生物學與加工重點實驗室，青島 266101；2.中國農業科學院研究生院，北京100081；3.青島農業大學農學與植物保護學院，青島 266109；4.上海煙草集團有限責任公司，上海 200082）

不同生態區域烤煙煙葉香氣物質分析

李玲燕1，2，3，徐宜民1*，劉百戰4，王程棟1，畢艷玖4，劉曉冰1，2，楊 凡3，王樹聲1*

（1.中國農業科學院煙草研究所，農業部煙草生物學與加工重點實驗室，青島 266101；2.中國農業科學院研究生院，北京100081；3.青島農業大學農學與植物保護學院，青島 266109；4.上海煙草集團有限責任公司，上海 200082）

為明確不同生態區域烤煙關鍵香氣物質種類，并依據香氣物質對不同生態區域進行分類，采用正己烷常溫萃取法和液相-氣相-質譜聯用技術對不同烤煙風格6個生態區域烤煙煙葉香氣物質進行測定。結果表明，不同生態區域煙葉有14種香氣物質差異顯著，貴州中部山區煙葉中巨豆三烯酮等8種香氣物質含量顯著高于其他產區。主成分分析表明，巨豆三烯酮、茄酮和降茄二酮是不同風格烤煙的關鍵香氣物質；以貴州中部山區煙葉香氣物質的主成分得分排名最高，云貴高原產區排名最低。通過主成分聚類分析將6個生態區劃分為3類，第1類以貴州中部山區為主；第2類以秦巴山區為主；第3類以武陵山區為主，而山東產區、東北產區和云貴高原產區的取樣點分別在第2、3類中分布。基于煙葉香氣物質含量的不同生態區烤煙評價和分類是可行的。

不同生態區域；烤煙；香氣物質

我國烤煙按其香氣風格分為清香型、中間香型和濃香型三大類，其中，中間香型所占的比例最高。中間香型煙葉產區從云貴高原到長白山麓，產區跨度大，生態條件相差懸殊。不同生態區之間煙葉風格特色差別較大，煙葉質量特色或風格與生態條件、品種、栽培措施、調制方法等多種因素有關［1-4］，其中，生態條件是主要影響因素［5］。生態條件等因素造成的煙葉香氣物質含量和比例的差異是煙葉香氣風格不同的重要原因［6］。因此，人們圍繞煙葉香氣物質開展了大量研究。有研究認為，煙葉中新植二烯和類胡蘿卜素降解產物的含量對煙葉香氣質量有重要影響［7-8］；王能如等［9］認為大馬酮、巨豆三烯酮、茄酮等最能代表我國烤煙主體香味成分；李章海等［10］認為不同產區煙葉香氣指數的差異由茄酮、大馬酮等主導。綜上所述，煙葉質體色素和西柏烷類降解產物對香氣質量貢獻較大［3，8-9，11］；但由于煙葉香氣物質種類的多樣性及其與煙葉質量關系的復雜性，目前，煙葉關鍵香氣物質評價指標并未得到廣泛認同。為此，本研究以不同風格烤煙生態區煙葉樣品為研究對象，分析不同生態區烤煙香氣物質的差異，篩選煙葉關鍵香氣物質指標，以期為特色優質煙葉開發和煙葉香型風格產區定位提供理論依據。

表1 不同生態區烤煙取樣點信息Table 1 Sampling points information of flue-cured tobacco from different ecological region

1 材料與方法

1.1 供試材料

選取武陵山區、貴州中部山區、秦巴山區、山東產區、東北產區、云貴高原產區6個烤煙典型生態區［12］，以25個有代表性的取樣點2011年的C3F煙葉樣品共115份為研究材料，如表1所示，樣品來源由國家煙草專賣局特色優質煙葉開發重大專項“中間香型特色優質煙葉生態基礎研究”課題提供。煙葉樣品磨粉制備后用于香氣物質測定。

1.2 香氣物質含量測定

采用上海煙草集團技術中心改進的正己烷常溫萃取前處理方法和液相-氣相-質譜聯用的測定技術［13］，根據相關研究結果［3，8-9，11］，具體測定茄酮、β-大馬酮、β-二氫大馬酮、香葉基丙酮、降茄二酮、β-紫羅蘭酮、氧化紫羅蘭酮、二氫獼猴桃內酯、巨豆三烯酮（1、2、3、4）、3-羥基大馬酮、3-氧代-α-紫羅蘭醇、新植二烯、3-羥基索拉韋惕酮和法尼基丙酮17種香氣物質的含量。

1.3 香氣物質測定前處理

稱取過60目篩的煙末樣品0.2000 g于15 mL螺口試管內，加5 mL正己烷和200 μL α-紫羅蘭酮內標溶液（11.2 μg/mL），渦旋振蕩1 min，靜置過夜，再次渦旋振蕩，3000 r/min離心5 min，取上清液1～1.5 mL至色譜樣品瓶待測。

1.4 香氣物質檢測條件

GPC色譜條件：Shodex CLNapk EV-200柱（2.0 mm I D×150 mm，日本昭和）；流動相二氯甲烷；流速0.05 mL/min，進樣量20 μL；柱溫30 ℃；DAD檢測波長254和320 nm；LC切割范圍為5.7～7.4 min。PTV條件：襯管填充物為硅烷化玻璃珠（80～100目），進樣口初始溫度40 ℃，保持9.2 min，恒壓模式，進樣口初始壓力0.5 psi，保持8.5 min，后迅速升為20 psi，脫附溫度280 ℃，一直持續到試驗結束；分流口4.2 min打開，排空流量100 mL/min，9 min關閉，11.5 min打開，排空流量50 mL/min，吹掃流速50 mL/min。

GC/MS條件：色譜柱DB-5M（0.32 mmI.D×30 mm，膜厚0.25 md.f.）爐溫箱初始溫度42 ℃，保持11.5 min，以5 ℃/min升到200 ℃，再以10 ℃/min升至280 ℃，保持15 min；MS電離方式EI；電離能量70 eV；傳輸線溫度280 ℃；離子源溫度230 ℃；質量范圍35～350；溶劑延遲20 min；質譜鑒定采用NIST98和WILEY6.0譜庫并聯檢索。

1.5 數據處理

運用Excel 2010和SAS9.1軟件進行數據處理與統計分析，采用廣義線性模型進行差異顯著性分析，Princomp和Score過程步進行主成分和得分分析及離差平方和法進行聚類分析。

表2 不同生態區域烤煙香氣物質含量差異分析 μg/gTable 2 Analysis on the contents of aroma components in tobacco from different ecological regions μg/g

2 結 果

2.1 不同生態區烤煙香氣物質含量差異

表2結果表明，不同生態區煙葉中β-大馬酮、降茄二酮和β-紫羅蘭酮3種香氣物質的含量差異不顯著，其余14種香氣物質至少在兩個區域間的含量差異達顯著水平。以秦巴山區茄酮含量較高，西南云貴高原產區β-二氫大馬酮含量較高，東北產區香葉基丙酮含量較高，貴州中部山區煙葉中的巨豆三烯酮（1、2、3、4）、3-羥基大馬酮、3-氧代-α-紫羅蘭醇、新植二烯、法尼基丙酮的含量均顯著高于其他產區。煙葉香氣物質中均以新植二烯的含量較高，β-大馬酮、β-二氫大馬酮的含量較低；巨豆三烯酮4個同分異構體的含量均表現為巨豆三烯酮4＞巨豆三烯酮2＞巨豆三烯酮3＞巨豆三烯酮1。

2.2 不同生態區烤煙關鍵香氣物質篩選

香氣物質之間有復雜的降解轉化關系，為了研究這些有一定相關關系的指標，采用主成分分析法篩選不同生態區烤煙關鍵香氣物質，主成分分析特征值見表3。第1主成分方差貢獻率為41.24%，第2主成分方差貢獻率為23.76%，第3主成分方差貢獻率為14.68%，第4主成分方差貢獻率為7.88%，前4個主成分的累計方差貢獻率達到87.45%。因此，提取這4個主成分基本代表了原變量的特征、差異和相互關系。

4個主成分的載荷矩陣見表4。第1主成分主要由巨豆三烯酮決定，巨豆三烯酮4個同分異構體有較大的載荷，此外，新植二烯的載荷也較大；第2主成分主要由茄酮、降茄二酮決定，β-大馬酮、β-紫羅蘭酮的載荷也較大；第3主成分主要由氧化紫羅蘭酮、二氫獼猴桃內酯決定；第4主成分主要由香葉基丙酮、3-羥基大馬酮決定。總體上，第1、2主成分對煙葉香氣物質的貢獻較大，達64.99%，而第3、4主成分相對貢獻較小，說明以質體色素降解產物巨豆三烯酮4個同分異構體為主體的第1主成分和以西柏烷類代謝產物茄酮和降茄二酮為主體的第2主成分對煙葉香氣物質有較大貢獻。

表3 主成分特征值及方差貢獻率Table 3 Eigenvalues of principal components and their cumulative contribution

表4 主成分載荷矩陣Table 4 Principal component loading matrix

2.3 不同生態區烤煙關鍵香氣物質得分

前4個主成分得分見表5。以巨豆三烯酮4個同分異構體為代表的第1主成分得分最高的4個取樣點是開陽、余慶、凱里和貴定，均屬貴州中部山區；得分最低的4個取樣點是房縣、威寧、旬陽和興山，除威寧外，均屬秦巴山區。主成分綜合得分排名前4位的取樣點分別是開陽、凱里、貴定、余慶，均屬貴州中部山區；排名最低取樣點是威寧，屬于云貴高原產區。不同生態區中，貴州中部山區主成分綜合得分排名最高，各取樣點主成分得分平均值為1.7240；山東產區排名最低，各取樣點主成分得分平均值為-0.6477。第1主成分的方差貢獻達41.24%，主宰了主成分綜合得分的等級，結合不同生態區烤煙香氣物質含量方差分析來看，貴州中部山區煙葉的主成分得分排名較高，與該地區煙葉中巨豆三烯酮、新植二烯、法尼基丙酮等含量較高有關。

2.4 不同生態區烤煙關鍵香氣物質聚類分析

采用離差平方和法對不同生態區烤煙關鍵香氣物質進行聚類分析，分析結果見圖1，從距離0.150處劃分為3類。

第1類包含4個取樣點，為貴州中部山區（余慶、凱里、貴定、開陽）4個點，類別間方差分析表明，此類別煙葉中巨豆三烯酮、3-羥基大馬酮、3-氧代-α-紫羅蘭醇、新植二烯及法尼基丙酮的含量極顯著高于類別2、3（P＜0.0001）。除西秀外，貴州中部山區的取樣點均集中在這一類中，并明顯區分于其他生態區的取樣點。

第2類包含8個取樣點，其中秦巴山區（旬陽、興山、房縣）3個點，山東產區（臨朐、蒙陰）2個點，武陵山區（咸豐）1個點，西南云貴高原產區（盤縣）1個點，東北產區（汪清）1個點，此類別煙葉中巨豆三烯酮、3-羥基大馬酮和新植二烯的含量較低；茄酮（P＜0.0001）、降茄二酮（P=0.0002）和二氫獼猴桃內酯（P＜0.0001）的含

量極顯著高于其他類。第3類包含13個取樣點，其中武陵山區（德江、道真、利川、桑植、鳳凰、武隆）6個點，云貴高原產區（興仁、威寧）2個點，秦巴山區（南鄭、巫山）2個點，貴州中部山區（西秀）1個點，山東產區（費縣）1個點，東北產區（寬甸）1個點，此類別煙葉中茄酮和降茄二酮含量較低，巨豆三烯酮的含量介于第1、2類之間。

表5 標準化后主成分得分Table 5 Principal component scores after standardization

圖1 不同生態區烤煙香氣物質主成分聚類分析Fig. 1 Clustering figure charged with selected indices of aroma components in flue-cured tobacco from different ecological regions

第1類中只分布貴州中部山區的取樣點，并明顯區分于其他生態區的取樣點，說明中間香型不同生態區的取樣點香氣物質之間有明顯的區別，反映了不同生態區間生態條件的迥異；同一生態區，以武陵山區為例，咸豐取樣點位于第2類中，而武陵山區其他6個取樣點均在第3類中，說明同一生態區的取樣點香氣物質之間也有一定的差異，同一生態區的取樣點雖然具有生態條件相似的基礎，但又在具體小氣候和小尺度生態條件上有一定的差異。

3 討 論

不同生態區煙葉香氣物質中有14種香氣物質差異顯著，說明生態條件對香氣物質含量影響顯著，很多研究［3，14-15］也佐證了這一觀點，但本研究中β-大馬酮、巨豆三烯酮等質體色素降解產物的含量較以往研究低，分析原因可能是香氣物質前處理方法不同引起的。

本研究認為巨豆三烯酮、茄酮和降茄二酮是影響烤煙風格的關鍵香氣物質；而王能如等［9］認為大馬酮、巨豆三烯酮、茄酮（含降茄二酮）等最能代表我國烤煙主體香味成分，雖然本研究和王能如的研究區域、對象和方法都不盡相同，但在巨豆三烯酮和茄酮、降茄二酮是烤煙香氣物質關鍵指標這個觀點上相互印證，只是在大馬酮作為主體香味成分上存在分歧，分析原因可能是王能如采用的是同時蒸餾萃取（SDE）方法進行前處理，此過程中長時間加熱，導致部分香氣成分前體物裂解成小分子的大馬酮等香氣物質，使最終測得的大馬酮等含量高于樣品實際含量，而本研究前處理為常溫萃取法，減少了大分子前體物裂解成小分子物質的可能性，故本研究中β-大馬酮含量極低，且不同生態區之間的含量差異不顯著，未被認定為不同生態區烤煙關鍵香氣物質。本研究取樣點主要集中在傳統中間香型產區，所得到的關鍵香氣物質成分對傳統中間香型產區有一定的借鑒意義，要全面深入把握烤煙的關鍵香氣物質，有待進一步采用不同產區不同香型風格的樣品進行對比研究。

貴州中部山區煙葉主成分得分排名較高，而云貴高原產區排名較低，高低只是對主成分數值大小的排序，僅表示煙葉中巨豆三烯酮等主成分香氣物質含量的高低，并不直接代表煙葉質量的高低，煙葉質量是多種物理化學性狀的綜合體現。

聚類分析結果表明，不同生態區取樣點之間既有明顯分離，又有所交叉，說明香氣物質含量與具體生態條件有關，前人對單一地區煙葉香氣物質與生態因子的關系研究認為，巨豆三烯酮含量與土壤有機質及積溫條件有關［16-17］；茄酮和降茄二酮含量與日照時數關系密切［18］，下一步應充分發揮本研究取樣點廣泛的優勢，結合生態因子進行分析，從而篩選出影響香氣物質含量的關鍵生態因子。

4 結 論

不同生態區烤煙煙葉香氣物質含量差異顯著，巨豆三烯酮、茄酮和降茄二酮是中間香型烤煙的關鍵香氣物質，貴州中部山區煙葉香氣物質主成分得分和巨豆三烯酮等8種香氣物質含量顯著高于其他產區。6個生態區為3類，第1類以貴州中部山區為主；第2類以秦巴山區為主；第3類以武陵山區為主，而山東產區、東北產區和西南云貴高原產區的取樣點分別在第2、3類區域中分布。

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Analysis of Aroma in Flue-cured Tobacco Leaves from Different Ecological Regions

LI Lingyan1，2，3， XU Yimin1*， LIU Baizhan4， WANG Chengdong1， BI Yanjiu4，LIU Xiaobing1，2， YANG Fan3， WANG Shusheng1*
（1. Tobacco Research Institute of CAAS， Key Laboratory of Tobacco Biology and Processing， Ministry of Agriculture， Qingdao 266101， China； 2. Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100081， China； 3. College of Agriculture and Plant Protection， Qingdao Agricultural University， Qingdao 266109， China； 4. Shanghai Tobacco Group Co.， Ltd.， Shanghai 200082， China）

The main purpose of this study was to explore the key aroma in flue-cured tobacco leaves， and to classify different ecological regions tobacco based on this. Seventeen aroma were analyzed by N-hexane solvent extraction and liquid chromatographygas chromatography-mass spectrometry （LC-GC-MS） method with 115 flue-cured tobacco samples collected from 25 sampling points in six ecological regions. Principal component analysis and cluster analysis were conducted on the determination results of aroma. Results showed that the contents of fourteen aroma components were significantly different among flue-cured tobacco leaves from different ecological regions. Moreover， eight aroma components including megastigmatrienonel in flue-cured tobacco leaves of mountainous areas of central Guizhou were significantly higher than the other regions. Principal component analysis suggested that the key of aroma components in flue-cured tobacco leaves included megastigmatrienonel， solanone and norsolandione. The highest score of principal component was from the mountainous areas of central Guizhou， while the lowest score was from Yunnan， Guizhou plateau production areas. Using principal component-cluster analysis method based on the contents of aroma components in flue-cured tobacco leaves， the six ecological regions tobacco in this study could be divided into three clusters， with the first one represented by the mountainous areas of central Guizhou， the second one represented by the mountainous areas of Qinba， and the third one represented by the mountainous areas of Wuling. In addition， the sampling points of Shandong production areas， Northeast production areas and Yunnan， Guizhou plateau production areas belonged to the second and third cluster respectively. Aroma components can be used in evaluating and classification of flue-cured tobacco from different ecological regions.

different ecological regions； flue-cured tobacco； aroma

TS41+1

1007-5119（2015）03-0001-07

10.13496/j.issn.1007-5119.2015.03.001

國家煙草專賣局特色優質煙葉開發重大專項“中間香型特色優質煙葉生態基礎研究”（TS-02-20110012）

李玲燕（1981-），講師，在讀博士，研究方向為煙草品質與生態。E-mail：lilingyan2395@sina.com

*通信作者，E-mail：xuyimin@caas.cn；E-mail：wangshusheng@caas.cn

2015-02-06

2015-04-10