煙草茄尼醇含量的遺傳分析

向德虎，趙韜智，杜詠梅，張忠鋒，閆 寧，黃文昌，王愛(ài)華，付秋娟，宮亞楠，劉艷華*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，煙草遺傳改良與生物技術(shù)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，青島 266101；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院，哈爾濱 150030；4.湖北省煙草科學(xué)研究院，武漢 430030）

煙草茄尼醇含量的遺傳分析

向德虎1，2，趙韜智3，杜詠梅1，張忠鋒1，閆 寧1，黃文昌4，王愛(ài)華1，付秋娟1，宮亞楠1，劉艷華1*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，煙草遺傳改良與生物技術(shù)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，青島 266101；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院，哈爾濱 150030；4.湖北省煙草科學(xué)研究院，武漢 430030）

為探索與煙葉中茄尼醇含量相關(guān)基因的遺傳模式，以低茄尼醇含量煙草種質(zhì)Maryland609為母本、高茄尼醇含量煙草種質(zhì)K326為父本配制雜交組合，建立P1、P2、F1、F2的4個(gè)世代遺傳分析群體，利用UPLC（超高效液相色譜）進(jìn)行茄尼醇的定量檢測(cè)，通過(guò)“主基因+多基因”混合遺傳模型多世代聯(lián)合分析對(duì)與茄尼醇含量相關(guān)的基因進(jìn)行遺傳分析。結(jié)果表明，Maryland609×K326組合的茄尼醇含量受2對(duì)等顯性主基因+加性顯性多基因（E6）控制，2對(duì)主基因的加性效應(yīng)和顯性效應(yīng)值相等，均為負(fù)值，多基因的顯性效應(yīng)大于加性效應(yīng)；主基因的遺傳率分別為33.61%和53.15%，多基因遺傳率分別為30.01%和13.64%，環(huán)境變異在33.21%～36.28%。因此，主基因和多基因共同決定了煙葉茄尼醇的含量，以主基因遺傳為主，同時(shí)受到環(huán)境的影響。

煙草；茄尼醇；主基因+多基因；遺傳效應(yīng)

煙草（Nicotiana tabacum）為茄科（Solanaceae）煙屬植物，起源于美洲、大洋洲及南太平洋，是一種在世界范圍內(nèi)廣泛種植的經(jīng)濟(jì)作物［1-2］。煙草不僅僅是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，還因其含有茄尼醇、蕓香苷、甾醇、綠原酸等有益活性成分而具有十分重要的醫(yī)藥價(jià)值，在食品和藥物資源開(kāi)發(fā)方面具有巨大的潛在用途。茄尼醇（Solanesol）是一種四倍半烯萜醇，因其是合成CoQ10和維生素K2等暢銷藥品的主要中間體，而具有十分重要的醫(yī)藥價(jià)值［3-4］。由于茄尼醇具有較長(zhǎng)的碳鏈結(jié)構(gòu)，目前還不能通過(guò)工業(yè)大量合成，只能依賴于植物組織中提取［5］。而煙葉中茄尼醇含量最高，使得煙葉成為提取茄尼醇的主要原料［6-7］。隨著我國(guó)茄尼醇提取技術(shù)與工藝的不斷突破，原材料中茄尼醇含量成為茄尼醇獲得量的主要限制因素。因此，高茄尼醇含量煙葉對(duì)茄尼醇在醫(yī)藥中的開(kāi)發(fā)和利用具有重要的應(yīng)用價(jià)值。但高茄尼醇含量煙葉主流煙氣焦油、一氧化碳、苯并芘等有害物質(zhì)的釋放量也高［8］。Schlotzhauer等［9］研究表明，煙草中茄尼醇熱解對(duì)煙氣稠環(huán)芳烴的貢獻(xiàn)高達(dá)30%。所以對(duì)煙草中茄尼醇含量進(jìn)行遺傳分析，可為不同茄尼醇含量煙草資源的創(chuàng)制和利用提供最直接的實(shí)踐指導(dǎo)。

蓋鈞鎰［10-11］等基于傳統(tǒng)數(shù)量遺傳學(xué)提出了“主基因+多基因”混合遺傳模型，可對(duì)植物的數(shù)量性狀進(jìn)行遺傳分析，該方法目前在棉花、玉米、大豆、小麥、花生、水稻［12-17］等作物研究中被廣泛應(yīng)用。近年來(lái)該方法在煙草產(chǎn)量、品質(zhì)、抗病性等方面的研究報(bào)道［18-22］也在持續(xù)增加。目前對(duì)煙草中

茄尼醇的研究主要集中在茄尼醇的提取純化［23-25］、環(huán)境因素對(duì)煙葉茄尼醇含量的影響［26］以及茄尼醇合成途徑中關(guān)鍵酶基因的克隆［27-28］等方面，而對(duì)與煙葉茄尼醇含量相關(guān)基因的遺傳研究較少。本研究通過(guò)高、低茄尼醇含量煙草種質(zhì)配制雜交組合，建立P1、P2、F1、F2的4個(gè)世代群體，在煙葉工藝成熟期測(cè)定其茄尼醇含量，并利用“主基因+多基因”混合遺傳模型進(jìn)行分析，確定其遺傳模型，估算遺傳率，為高、低含量茄尼醇煙草種質(zhì)的創(chuàng)新與利用提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

前期通過(guò)對(duì)160份煙草種質(zhì)資源茄尼醇含量的測(cè)定，篩選出低茄尼醇含量種質(zhì)Maryland609和高茄尼醇含量種質(zhì)K326，配制雜交組合：獲得F1，F(xiàn)1自交，獲得F2分離群體，構(gòu)成進(jìn)行遺傳分析的P1、P2、F1、F2四個(gè)世代群體。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所山東青島即墨農(nóng)場(chǎng)和湖北恩施農(nóng)場(chǎng)進(jìn)行。2012年在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所溫室播種P1和P2，并進(jìn)行雜交，獲得F1的種子；2013年在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所即墨農(nóng)場(chǎng)種植F1，自交得到F2代種子；2014年在湖北恩施農(nóng)場(chǎng)分別種植P1、P2、F1世代群體各50株，F(xiàn)2世代群體200株，2015年在湖北恩施農(nóng)場(chǎng)種植F2世代群體200株。各個(gè)群體植株的田間排列為P1、P2、F1和F2，行距1.2 m，株距0.5m。P1、P2、F1種植2行，每行25株，F(xiàn)2種植8行，每行25株。各供試材料按當(dāng)?shù)卦耘喙芾泶胧┻M(jìn)行管理。

1.3 茄尼醇含量測(cè)定

取樣和制樣：打頂后工藝成熟期取中部葉，每株取2片煙葉，按單株進(jìn)行掛牌編號(hào)，P1、P2、F1各取30株，2014年F2取177株，2015年F2取150株。將鮮煙葉樣品帶回實(shí)驗(yàn)室，去主脈，放入DHG-9240A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱105 ℃殺青10 min，然后在60 ℃條件下烘干。

利用UPLC（超高效液相色譜）進(jìn)行茄尼醇的定量分析檢測(cè)。

茄尼醇檢測(cè)方法參照文獻(xiàn)［29］，進(jìn)一步優(yōu)化提取條件后，超高效液相色譜檢測(cè)。稱取過(guò)40目篩煙草粉末樣品0.1 g（精確至0.0001 g）于20 mL帶有聚四氟乙烯密封蓋的離心玻璃管中，加入1.0 mL 0.1 mol/L的氫氧化鈉乙醇溶液作為皂化劑，再加入5.0 mL正己烷作為萃取劑；蓋上密封蓋，震蕩搖勻，放入恒溫超聲提取器（超聲頻率45 kHz，溫度40～50 ℃）中提取30 min；取出，冷卻至室溫后旋開(kāi)密封蓋，加入8 mL去離子水，蓋緊密封蓋，充分震蕩后，3000 r/min離心10 min；移取上層正己烷茄尼醇提取液，用流動(dòng)相稀釋10倍，用0.22 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾至液相安瓿瓶中，用液相色譜進(jìn)行檢測(cè)（色譜條件為，色譜柱：BEH C18 1.7μm 2.1*100 mm；流動(dòng)相：甲醇；流速：0.5 mL/min；柱溫：35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm）。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用章元明等［10］的植物“主基因+多基因”混合遺傳模型對(duì)本試驗(yàn)P1、P2、F1、F2四個(gè)世代的茄尼醇含量進(jìn)行多世代聯(lián)合分析。利用極大似然（ML， max-like lihood）法和IECM（Iterated expectation and conditional maximization）對(duì)各世代各相關(guān)成分的分布參數(shù)進(jìn)行估計(jì)，獲得所有遺傳模型的分布參數(shù)估計(jì)值，根據(jù)AIC（Akaike′s information criterion）值選取備選模型，再進(jìn)行適合性檢驗(yàn)［均勻性檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量）和Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)（nW2統(tǒng)計(jì)量和Dn統(tǒng)計(jì)量）］。然后結(jié)合AIC準(zhǔn)則（最小值）和適合性檢測(cè)篩選最優(yōu)模型，最后利用最小二乘法估算各基因的效應(yīng)值，并分析相應(yīng)的遺傳效應(yīng)［10-11］。

通過(guò)P1、P2以及F1的無(wú)偏估計(jì)可估計(jì)誤差方差σ2，結(jié)合分離世代群體估算出主基因和多基因的遺傳方差（），進(jìn)而得出主基因和多基因的遺傳率（）。主基因與多基因的遺傳方差和遺傳率的計(jì)算公式［10］如下：

另外，利用浙江大學(xué)朱軍教授提供的軟件（QTModel）進(jìn)行異常數(shù)據(jù)檢測(cè)，利用Excel2010進(jìn)行頻次分布圖的制作，利用SAS9.2軟件進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)以及群體間差異性檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 煙草茄尼醇含量檢測(cè)值的表型數(shù)據(jù)分析

各個(gè)世代茄尼醇檢測(cè)值的頻次分布見(jiàn)表1。Maryland609和K326茄尼醇含量的平均值分別為1.402%和1.909%，通過(guò)SAS9.2分析，P1和P2兩個(gè)世代茄尼醇含量的差異達(dá)到顯著水平（p＜0.05）。F1世代茄尼醇含量的平均值為1.632%，介于兩親本之間，略低于兩親本的平均值。分離世代群體F2的標(biāo)準(zhǔn)差、變異系數(shù)和極差值均比不分離世代群體（P1、P2、F1）大，說(shuō)明分離世代群體內(nèi)部離散程度比較大，適于進(jìn)一步的遺傳分析。

2.2 煙草茄尼醇含量測(cè)得值的頻次分布

將兩年F2世代茄尼醇檢測(cè)值進(jìn)行分組，統(tǒng)計(jì)其分布頻數(shù)（圖1）可以看出，后代F2的分布既不呈簡(jiǎn)單的單基因控制的3∶1的規(guī)律，也不呈兩個(gè)基因控制的9∶3∶3∶1的規(guī)律，而是呈現(xiàn)有主峰的偏態(tài)分布，因此認(rèn)為與茄尼醇含量相關(guān)的遺傳既有主效基因的作用，也有微效多基因的作用。

2.3 煙草茄尼醇含量的遺傳模型

采用植物數(shù)量性狀“主基因+多基因”混合遺傳模型的多世代聯(lián)合分析方法對(duì)煙草組合Maryland609×K326的4個(gè)世代茄尼醇含量進(jìn)行分析獲得5類共24種模型的極大似然值MLV（maxlike lihood-values）和AIC值，分別為1對(duì)主基因（A），2對(duì)主基因（B），多基因（C），1對(duì)主基因+多基因（D）和2對(duì)主基因+多基因（E）。由表2可以看出，在2014年，E4模型（2對(duì)等加性主基因+加性顯性多基因混合遺傳模型）、E5模型（2對(duì)完全顯性主基因+加性顯性多基因模型）和E6模型（2對(duì)等顯性主基因+加性顯性多基因模型）的AIC值相對(duì)較小，分別是203.0297、203.876和201.4873，初步篩選E4、E5、E6作為備選模型。在2015年，E2模型（2對(duì)完全顯性主基因+加性顯性多基因模型）和E6模型（2對(duì)加性顯性主基因+加性顯性多基因模型）的AIC值相對(duì)較小，分別為389.1459和383.2935，初步篩選E2、E6作為備選模型。兩年的備選模型都包括E6模型，且E6模型的AIC值最小。

表1 世代茄尼醇含量的頻次分布Table 1 Frequency distribution of solanesol content of generations

圖1 分離世代（F2）群體茄尼醇含量頻次分布Fig. 1 Frequency distribution of solanesol content of F2 generations

進(jìn)一步對(duì)這3個(gè)備選模型分別進(jìn)行均勻性和Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)，獲得其相關(guān)的統(tǒng)計(jì)量（和Dn）及p值，統(tǒng)計(jì)備選模型中達(dá)到顯著水平的統(tǒng)計(jì)量個(gè)數(shù)，個(gè)數(shù)最少的模型為最優(yōu)模型。由表3可以看出，2014年的3個(gè)備選模型和2015年的2個(gè)備選模型均只在P1世代的檢驗(yàn)中達(dá)到了顯著水平（p ＜ 0.05），然后進(jìn)行極大似然比檢驗(yàn)，得到分離世代各個(gè)基因型的后驗(yàn)概率，進(jìn)行方差分析。由表4可知，在2014年，E4模型與E5、E6模型之間均存在極顯著差異，E5模型的AIC值大于E6模型，依據(jù)AIC最雖小原則選擇E6模型為最優(yōu)遺傳模型；在2015年，E2和E6模型之間存在極顯著差異，E2模型的AIC值大于E6模型，同理選擇E6模型為最優(yōu)遺傳模型。兩年的數(shù)據(jù)初步確定煙草中茄尼醇含量的遺傳是由2對(duì)等顯性主基因+加性-顯性多基因控制。

2.4 遺傳參數(shù)估計(jì)

根據(jù)選定的茄尼醇含量最適遺傳模型相關(guān)參數(shù)的極大似然估計(jì)值，可估算該模型相應(yīng)的遺傳參數(shù)。由表5可知，2年試驗(yàn)結(jié)果遺傳參數(shù)da=db，且均為負(fù)向效應(yīng)，說(shuō)明2對(duì)主基因的加性效應(yīng)相等，2對(duì)主基因同時(shí)存在時(shí)，可有效降低煙葉茄尼醇的含量，表明對(duì)主效基因進(jìn)行累加選擇可以降低茄尼醇的含量；2對(duì)主基因的顯性效應(yīng)ha=hb，即顯性效應(yīng)相等，均為負(fù)效應(yīng)；2對(duì)主基因顯性度的絕對(duì)值|ha/da|、|hb/db|都等于1，說(shuō)明2對(duì)主基因的加性效應(yīng)和顯性效應(yīng)相等，也均為負(fù)效應(yīng)。多基因的顯性效應(yīng)值［h］大于加性效應(yīng)值［d］，且均為正向效應(yīng)，具有正向超顯性作用。說(shuō)明在高茄尼醇種質(zhì)創(chuàng)新過(guò)程中，對(duì)多基因遺傳效應(yīng)的應(yīng)用應(yīng)注重雜種優(yōu)勢(shì)的利用，同時(shí)也可對(duì)多基因進(jìn)行累加選擇以提高煙葉茄尼醇含量。

表 2 各遺傳模型的MLV和AIC值Table 2 MLV and AIC values of each genetic model

表4 備選模型方差分析Table 4 the ANOVA of alternative models

表5 茄尼醇含量E6模型遺傳參數(shù)估計(jì)值Table 5 Estimate values of genetic parameters in E6 model

二階遺傳參數(shù)主基因遺傳率分別為33.61%和53.15%，多基因遺傳率分別為30.01%和13.64%，主基因+多基因的遺傳率分別是63.62%和66.79%，環(huán)境變異在33.21%～36.28%，因此，煙草茄尼醇含量主要由遺傳效應(yīng)控制，同時(shí)受環(huán)境因素影響也比較大。

3 討 論

“主基因+多基因”混合遺傳模型在蓋鈞鎰等［11］的研究下不斷發(fā)展，多世代聯(lián)合分析已從4世代聯(lián)合分析發(fā)展到6世代聯(lián)合分析，由于該遺傳模型適用于植物數(shù)量性狀的遺傳分析而被廣泛應(yīng)用。方先文等［14］、李廣軍等［16］、李余生等［15］先后利用“主基因+多基因”混合遺傳模型多世代聯(lián)合分析的方法對(duì)小麥籽粒支鏈淀粉和總淀粉含量、大豆豆卷葉螟抗性、水稻稻曲病抗性進(jìn)行了遺傳分析，明確基因的遺傳規(guī)律，為小麥品質(zhì)育種、水稻和大豆的抗病育種做出了重要貢獻(xiàn)。“主基因+多基因”混合遺傳模型多世代聯(lián)合分析的方法在煙草中的運(yùn)用相對(duì)較晚，自2009年以來(lái)，主要應(yīng)用于煙草抗病、農(nóng)藝性狀以及代謝產(chǎn)物的遺傳分析。陳小翠等［30］利用該遺傳模型對(duì)P1、P2、F1、F2等4世代群體進(jìn)行了CMV抗性的遺傳分析，結(jié)果表明，在煙草的成株期，2個(gè)不同環(huán)境下均表現(xiàn)為2對(duì)主基因+多基因（E2）控制，主基因的遺傳率為36.57%。王日新等［31］利用“主基因+多基因”混合遺傳模型分析了3個(gè)組合4個(gè)世代株高的遺傳規(guī)律。目前，該方法也已經(jīng)被應(yīng)用于煙草代謝產(chǎn)物含量的遺傳分析，蔡長(zhǎng)春等［32-33］先后利用HD群體和P1、P2、F1、F2的4世代群體對(duì)煙堿含量和白肋煙煙堿轉(zhuǎn)化性狀進(jìn)行了遺傳分析。本研究利用4個(gè)世代聯(lián)合分析的方法研究了煙草代謝產(chǎn)物茄尼醇含量的遺傳規(guī)律，明確了在煙草中部葉成熟期茄尼醇含量的遺傳模型（E-6），結(jié)果表明，與茄尼醇含量相關(guān)的基因既存在多基因效應(yīng)，也存在主基因效應(yīng)，同時(shí)具有加性和顯性效應(yīng)，與David［34］的研究結(jié)果不盡一致。

本研究利用F2世代研究了與茄尼醇含量相關(guān)基因的遺傳規(guī)律，并設(shè)計(jì)了2年重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果均表明，煙草茄尼醇含量的遺傳受2對(duì)等顯性主基因+加性顯性多基因所控制（E6）。主基因的加性、顯性效應(yīng)均為負(fù)效應(yīng)，且效應(yīng)值相等。多基因的加性、顯性效應(yīng)均為正效應(yīng)，且加性效應(yīng)小于顯性效應(yīng)。主基因+多基因的遺傳效應(yīng)大于環(huán)境效應(yīng)，其中主基因的遺傳率大于多基因的遺傳率。但2年試驗(yàn)結(jié)果主基因的遺傳率和多基因的遺傳率存在差異，這可能與外界環(huán)境對(duì)茄尼醇含量的影響有關(guān)。因此，在后代選擇中，應(yīng)首先考慮主基因效應(yīng)，同時(shí)注重環(huán)境的影響。

4 結(jié) 論

本研究通過(guò)“主基因+多基因”混合遺傳模型多世代聯(lián)合分析的方法初步確定了煙草中茄尼醇含量的遺傳模型，并對(duì)其遺傳參數(shù)進(jìn)行了估計(jì)。初步認(rèn)為煙草中茄尼醇含量的遺傳符合2對(duì)等顯性主基因+加性-顯性多基因混合遺傳模型（E6）；主基因+多基因遺傳效應(yīng)大于環(huán)境效應(yīng)，說(shuō)明煙草葉片茄尼醇的含量主要受遺傳效應(yīng)控制，同時(shí)也受環(huán)境的影響。2對(duì)主基因的加性效應(yīng)和顯性效應(yīng)均為負(fù)值，說(shuō)明煙草茄尼醇含量存在加性負(fù)效應(yīng)和顯性負(fù)效應(yīng)，對(duì)主效基因的累加選擇可有效降低茄尼醇的含量。多基因間存在正向加性、顯性效應(yīng)，環(huán)境條件也對(duì)茄尼醇含量的遺傳造成部分影響。因此，在高茄尼醇種質(zhì)的創(chuàng)制中應(yīng)注重對(duì)多基因顯性效應(yīng)的應(yīng)用。

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Genetic Analysis on Solanesol Content of Tobacco

XIANG Dehu1，2， ZHAO Taozhi3， DU Yongmei1， ZHANG Zhongfeng1， YAN Ning1， HUANG Wenchang4，WANG Aihua1， FU Qiujuan1， GONG Yanan1， LIU Yanhua1*
（1. Key Laboratory of Tobacco Genetic Improvement and Biotechnology， Tobacco Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences， Qingdao 266101， China； 2. Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100081，China； 3. Northeast Agricultural University College of Life Science， Harbin 150030， China； 4. Tobacco Research Institute of Hubei Province， Wuhan 430030， China）

∶ To explore the genetic model of solanesol content of tobacco leaf， a cross was made with the low solanesol Maryland609 as maternal parent and the high solanesol K326 as paternal parent and populations of four generations （P1， P2， F1， F2） were obtained. Determination of solanesol content of the four populations was done with UPLC. Genetic analysis of solanesol content in tobacco was carried out using the joint segregation analysis method with a mixed genetic model of major gene plus polygene. The results showed that solanesol content of tobacco leaf appeared to be a quantitative trait and the inheritance fit to a mixed genetic model of two major genes with equal additive effects plus polygenes with additive-dominant effects （E6 model）.The results from two years showed that the additive effects and dominant effects of two major genes were equal and the quantitative value was negative. Dominant effects of polygenes were greater than additive effects. Heritabilities of the major genes were estimated to be 33.61% and 53.15%， respectively. Heritabilities of the polygenes were estimated to be 30.01% and 13.64%， respectively. The value of environmental variation was between 33.21%-36.28%. The results indicated that solanesol content of tobacco leaf was mainly controlled by major genes and poly genes， in which the major genes were dominant， and was effected by environmental factors at the same time.

tobacco； solanesol； major-gene plus polygenes； genetic effects

S572.03

1007-5119（2015）06-0001-07

10.13496/j.issn.1007-5119.2015.06.001

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)“煙草增香減害關(guān)鍵技術(shù)研究與示范”（201203091）

向德虎，男，在讀碩士，主要研究方向?yàn)闊煵莘N質(zhì)資源。E-mail：1559525145@qq.com。*通信作者，E-mail：liuyanhua@caas.cn

2015-02-05

2015-11-06