過氧化氫增氧引發對煙草種子活力的影響

馬文廣，利 站，鄭昀曄，李 潔，關亞靜，胡 晉*

過氧化氫增氧引發對煙草種子活力的影響

馬文廣1，3，利 站2，鄭昀曄1，3，李 潔2，關亞靜2，胡 晉2*

（1.云南省煙草農業科學研究院，云南 玉溪 653100；2.浙江大學農業與生物技術學院種子科學中心，杭州 310058；3.玉溪中煙種子有限責任公司，云南 玉溪 653100）

采用液體引發方法，使用過氧化氫為增氧劑，研究了過氧化氫結合GA3引發紅花大金元和云煙97種子的效果。利用不同濃度的H2O2結合50 mg/L GA3引發煙草種子，結果表明，含有增氧劑的引發液引發效果更好，顯著提高了種子活力。含有較高濃度增氧劑的引發液（GA3+25～100 mM H2O2）引發的煙草種子，種子發芽指數和活力指數顯著提高，平均發芽時間顯著縮短。GA3+50 mM H2O2引發液引發效果最好，種子活力最高。利用過氧化氫為增氧劑進行引發，可以大大簡化引發裝置，并取得較好的效果。

煙草；增氧引發；過氧化氫；種子活力

種子引發是提高種子活力的重要方法之一。種子引發是通過控制種子緩慢吸水，讓種子進入預發芽狀態。引發可促進種子萌發，且提高萌發整齊度，縮短出苗時間，提高幼苗素質和抗逆性，在生產上具有廣闊的應用前景。液體引發是將種子置于引發溶液中一定時間后，取出種子回干至原始水分。液體引發操作簡便，效果明顯，是目前最常用的引發方式之一。

目前，用于種子引發的藥劑很多，聚乙二醇、氯化鈣、赤霉素等都取得了不錯的效果［1］。孫剛［2］利用二甲基亞砜、水楊酸、赤霉素、氯化鈣等藥劑引發玉米種子，指出赤霉素可以顯著提高種子活力指數，并促進玉米幼苗的生長。張彥萍等［3］利用赤霉素對茄子種子引發后，可促進茄子種子活力，提高幼苗抗冷性。赤霉素在煙草種子引發同樣取得了良好的效果。聶新柏等［4］利用赤霉素結合KNO3、NaCl等試劑處理煙草種子，打破了煙草種子的休眠并提高種子活力。索文龍等［5］利用不同pH的赤霉素引發煙草種子，發現赤霉素引發顯著提高煙草幼苗素質，并且pH偏酸性的赤霉素溶液引發效果更好。

然而，液體引發過程中，種子呼吸代謝旺盛，急劇消耗引發液中的溶解氧，易對種子造成低氧脅迫，為保證引發液具有種子呼吸必需的充足氧氣，傳統方法是在液體引發過程中配置增氧裝置，使用氣泵向引發液中通入空氣，以緩解種子的低氧脅迫。但是，該方法不僅增加引發成本，還使引發裝置變得復雜，不利于引發技術的推廣。鄭昀曄等［6］嘗試使用過氧化鈣作為增氧劑對煙草種子進行引發，以替代傳統機械通氧，取得一定的效果。但是，上述方法中過氧化鈣溶于水后為懸濁液，仍需要不斷攪拌，才能使過氧化鈣與水充分反應產生氧氣，增加額外的勞動力，操作復雜程度不低于機械通氧。此外，過氧化鈣溶于水，會產生氫氧化鈣，使溶液呈堿性，無法與偏酸性的植物激素（赤霉素的化學結構屬于二萜類酸）或化學物質等混合使用，造成過氧化鈣增氧具有一定局限性。

過氧化氫水溶液呈弱酸性。過氧化氫在水中緩慢分解［7］，產生氧氣（2H2O2=2H2O+O2↑），因此，過氧化氫水溶液富含氧。最近研究表明，過氧化氫具有打破種子休眠的作用［8-10］，其打破種子休眠可能是促進GA合成，促進ABA分解并抑制其合成，從而促進種子快速發芽。這些研究為過氧化氫成為一種對種子有益的增氧劑提供了支持。但目前利用過氧化氫引發種子的研究很少，使用過氧化氫結合植物激素赤霉素引發更是未見報道。本試驗利用過氧化氫為增氧劑，結合赤霉素引發煙草種子，試圖在簡化引發程序、降低成本的同時，找到與常規引發劑如赤霉素等混合引發的最佳方法，提高種子活力。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

紅花大金元（簡稱紅大）、云煙97種子由玉溪中煙種子有限責任公司種子公司提供。赤霉素（GA3）購自美國Sigma公司，純度為95%。30%的H2O2溶液，購于國藥化學試劑公司。

1.2 試驗方法

利用9種不同的引發處理進行引發。分別為：（1）水引發，采用機械通氣（H2O + O2）；（2）50 mg/L GA3溶液引發，采用機械通氣（GA3+O2）；（3）50 mmol/L的H2O2溶液引發（50 mM H2O2）；（4）50 mg/L GA3溶液引發，不通氣（GA3+0 mM H2O2）；（5）50 mg/L GA3和10 mmol/L H2O2溶液引發（GA3+10 mM H2O2）；（6）50 mg/L GA3和25 mmol/L H2O2溶液引發（GA3+25 mM H2O2）；（7）50 mg/L GA3和50 mmol/L H2O2溶液引發（GA3+50 mM H2O2）；（8）50 mg/L GA3和100 mmol/L H2O2溶液引發（GA3+100 mM H2O2）；（9）50 mg/L GA3和200 mmol/L H2O2溶液引發（GA3+200 mM H2O2）。未處理的種子為對照（CK）。

煙草種子與引發液為1∶10（g∶mL）比例置于試管中，封口膜密封。在30 ℃條件下引發48 h后，用清水快速沖洗種子，常溫通風回干至原來水分。

1.3 溶氧含量的測定

在引發時間為0 h、2 h、6 h、12 h、18 h、24 h、36 h、48 h時，利用JPBJ-608便攜式溶氧儀測定引發液中的溶氧濃度。

1.4 發芽試驗

將引發后的煙草種子置于墊有3層水濕潤濾紙的培養皿（直徑90 mm）中，在光照培養箱中20～30 ℃（晚上16 h，白天8 h）變溫發芽16 d。每個處理采用100粒種子，3次重復。以種子露白為發芽標準，每天記錄發芽種子數，第7天計算發芽勢（germ ination energy，GE），第16天計算發芽率（germ ination percentage，GP）、發芽指數（germ ination index，GI）和平均發芽時間（mean germ ination time，MGT）。計算方法如下：

發芽勢（%）=（7 d內種子發芽數/受檢種子數）×100%；

發芽率（%）=（16 d內種子發芽數/受檢種子數）×100%；

發芽指數=∑（Gt/Dt）；

平均發芽時間（d）=∑（Gt×Dt）/∑Gt；式中，Gt為逐日發芽種子數，Dt為相應發芽日數［11］。

1.5 幼苗素質的測定

16 d發芽結束后，取幼苗用自來水沖洗干凈，用濾紙吸干表面水分。每個重復隨機選取50株幼苗，在80 ℃下烘24 h后稱干重（dry weight，DW）。3次重復。并計算活力指數（vigor index，VI）=GI×苗干重（g）。

1.6 數據分析

利用SAS軟件進行統計分析，方差分析前所有結果的百分率數據先經過反正弦轉換（y=arc sin［sqr（x/100）］），多重比較采用Lsd方法。

2 結 果

2.1 紅花大金元種子引發效果

2.1.1 紅花大金元種子引發液中溶氧的變化 紅大種子引發開始后，沒有H2O2增氧劑的引發液中溶氧含量快速下降，在18 h溶解氧含量降為0 mg/L（表1）。由此可見，種子在引發過程中確實伴隨著旺盛的呼吸。含有H2O2增氧劑的引發液，開始階段，H2O2分解產生氧氣的量大于種子呼吸消耗氧的量，隨著時間的推移，H2O2分解完畢，引發液中溶氧開始下降。在引發液H2O2濃度低于50 mmol/L時，相同的引發時間引發液中的溶氧含量與H2O2濃度呈正相關，但當H2O2濃度大于50 mmol/L時，相同的引發時間引發液中的溶氧含量變化不大，表明本試驗中50 mmol/L的H2O2分解產生的氧氣已經能滿足種子呼吸的需要。采用機械通氧的引發液溶氧量一直保持飽和狀態。

2.1.2 不同引發處理對紅花大金元種子發芽及幼苗生長的影響 經過引發的紅大種子發芽率、發芽指數和活力指數都顯著高于對照（表2），表明引發對提高種子發芽情況有很好的效果。GA3+O2和50 mM H2O2引發后，發芽指數顯著高于H2O+O2引發，平均發芽時間也顯著短于H2O+O2引發（表2），表明GA3和H2O2均可促進種子萌發。同時，含有較高濃度增氧劑的引發液（GA3+25～100 mM H2O2）較沒有增氧劑（GA3+0 mM H2O2）的引發液，種子發芽指數顯著提高，平均發芽時間顯著縮短。表明含有合適濃度增氧劑的引發液可以取得好的效果。其中，GA3+50 mM H2O2的引發效果最好，種子活力指數顯著高于GA3+O2和50 mM H2O2引發處理，表明H2O2除了有增氧效果外，還可能與GA3有協同增效的作用。GA3+200 mM H2O2的引發效果較差，有可能是過氧化氫濃度過高，對種子有一定損害作用。

2.2 云煙97種子引發效果

2.2.1 云煙97種子引發液中溶氧的變化 云煙97種子引發開始后，沒有H2O2增氧劑的引發液中溶氧含量快速下降，在24 h溶解氧含量降為0 mg/L（表3）。當H2O2濃度大于50 mmol/L時，相同的引發時間引發液中的溶氧含量變化不大，表明本試驗中50 mmol/L的H2O2分解產生的氧氣已經能滿足種子呼吸的需要。采用機械通氧的引發液溶氧量一直保持飽和狀態。

表1 紅花大金元種子不同引發液溶氧量的變化 mg/LTable 1 The dissolved oxygen content of different prim ing solutions used for Honghuadajinyuan seeds

2.2.2 不同引發處理對云煙97種子發芽及幼苗生長的影響 經過水引發和GA3+0 mM H2O2引發的云煙97種子，發芽勢、發芽率、發芽指數、干重和活力指數與對照均無顯著差異（表4）。其余引發處理的種子，發芽勢、發芽率、發芽指數都極顯著高于對照，發芽時間極顯著短于對照。GA3+O2引發后，發芽指數和活力指數都顯著高于GA3+0 mM H2O2引發，平均發芽時間也顯著短于GA3+0 mM H2O2引發（表4），表明引發液中溶氧含量（表3）對引發效果影響較大。GA3+50 mM H2O2的引發效果最好，種子發芽指數最高，平均發芽時間最短，種子活力指數極顯著高于GA 3+O2和50 mM H2O2引發處理，表明H2O2除了有增氧效果以外，還可能與GA3有協同增效的作用。

表2 不同引發處理對紅花大金元種子發芽及幼苗生長的影響Table 2 The effects of different prim ing treatments on Honghua Dajinyuan seed germ ination and seed ling grow th

3 討 論

種子引發是種子增值、提高種子商品性的重要種子處理技術之一［12］。種子引發可以提高種子活力，縮短種子發芽時間，提高出苗整齊率，提高逆境下的成苗率。引發過程中，種子內發生強烈的呼吸代謝，貯藏物質被分解，并為種子萌動提供能量，DNA和mRNA大量合成，一些代謝中關鍵酶活化［13］。赤霉素作為一種植物生長調節劑已在煙草［4-5］、水稻［14］、茄子［3］等植物種子引發上廣泛應用。

表3 云煙97種子不同引發液溶氧量的變化 mg/LTable 3 The dissolved oxygen content of different prim ing solutions used for Yunyan 97 seeds

表4 不同引發處理對云煙97種子發芽及幼苗生長的影響Table 4 The effects of different prim ing treatments on Yunyan 97 seed germ ination and seed ling grow th

引發過程中種子需要大量的氧氣去維持內部代謝的正常進行。本研究中，使用50 mg/L GA3溶液、不通氣的引發液（GA3+0 mM H2O2），紅大種子引發18 h后，云煙97種子引發24 h后，引發液中的溶氧降為0，說明引發過程中種子進行著旺盛的呼吸，并且紅大種子呼吸強度高于云煙97種子。同時，該引發液引發效果遠低于GA3+O2處理的種子，說明引發液中溶氧含量對引發效果影響很大。所以傳統的液體引發過程中，必須配有通氣裝置，增加了操作難度。而利用過氧化氫進行種子引發，無需額外的通氣裝置及攪拌工作，大大簡化了引發操作程序，有利于引發技術推廣。

過氧化氫溶液偏酸性，可增加種皮透性，有利于生長調節劑或營養物質快速進入種子內部。已有的研究報道表明在用GA3處理種子前，先用鹽酸或硫酸短時間處理種子，可以促進種子萌發［15］，與本研究結果相似。同時過氧化氫溶液可以抑制種子表面菌類的生長，進一步提高引發效果。

有學者在研究過氧化氫打破種子休眠時［8-10］，指出過氧化氫促進了GA3傳號信導。本研究中，GA3+50 mM H2O2的引發效果最好，種子活力指數均顯著高于GA3+O2和50 mM H2O2單獨引發處理，表明H2O2除了有增氧效果以外，還可能與GA3有協同增效的作用。說明H2O2引發種子，除了作為增氧劑，其本身可能參與一些激素（GA3等）傳號信導，從而促進增加一些激素的作用，取得更好的效果，其具體機理仍在進一步研究中。

過氧化氫可與現有引發技術中常用的赤霉素等引發劑引發種子，顯著提高種子的引發效果，簡化引發的操作程序，具有較好的應用前景。

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Effects o f Oxygen-Increasing Prim ing w ith Hyd rogen Peroxide on Tobacco Seed Vigor

MA Wenguang1，3， LI Zhan2， ZHENG Yunye1，3， LI Jie2， GUAN Yajing2， HU Jin2*
（1. Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Sciences， Yuxi， Yunnan 653100， China； 2. Seed Science Center， College of Agriculture and Biotechnology， Zhejiang University， Hangzhou 310058， China 3. Yuxi Zhongyan Tobacco Seed Co.， Ltd.，Yuxi，Yunnan 653100，China）

The liquid prim ing method was used to study the effects of hydrogen peroxide， as an oxygen-increasing reagent， used in combination with GA3 priming of Honghuadajinyuan and Yunyan 97 seeds. Different concentrations of H2O2were combined with 50 mg/L GA3 in prim ing tobacco seeds. The results showed that the priming solution contained hydrogen peroxide had better effects w ith significantly improved seed vigor. A fter treating w ith the prim ing solution w ith higher hydrogen oxygen （GA 3+25～100 mM H2O2） concentrations， seed germ ination index and vigor index were significantly increased， and the average germ ination time w as significantly shortened. The highest seed vigor was achieved by seed prim ing w ith GA3 in combination w ith 50 mM H2O2solution. The results suggested that prim ing w ith suitable concentrations of hydrogen peroxide could greatly improve tobacco seed vigor and simplify the device of priming.

tobacco seed； oxygen-increasing priming； hydrogen peroxide； seed vigor

S572.03

1007-5119（2015）05-0008-05

10.13496/j.issn.1007-5119.2015.05.002

云南省煙草公司科技計劃項目（2013YN10）

馬文廣（1972-），男，研究員，主要從事煙草品種選育及種子科學方面研究。E-mail：zhongzima@163.com。*通信作者，E-mail：jhu@zju.edu.cn

2015-05-29

2015-10-13