當歸補血顆粒早期干預結締組織生長因子防治高血壓腎損害及腎血管病變*

王琳娜 郭存霞 陳小永 楊華山

高血壓腎損害是原發性高血壓引起的良性小動脈性腎硬化和惡性小動脈性腎硬化及其伴有相應臨床表現的疾病。高血壓腎損害主要表現為血管的損害和腎間質纖維化。結締組織生長因子（Connective Tissue Growth Factor，CTGF）是轉化生長因子β1（Transform Growth Factorβ，TGF-β1）下游的重要致纖維化因子之一，早期干預CTGF表達，能阻止纖維化進程[1-2]。那么當歸補血顆粒（Danggui Buxue granules，DG）早期干預對高血壓腎損害的血管病變有無治療作用，早期用藥是否與CTGF表達相關，本研究將對此進行探討。

1 資料與方法

1.1 一般資料 36只成年雄性自發性高血壓大鼠（Spontaneously Hypertensive Rats，SHR）及10只同源雄性（Wistar-Kyoto，WKY）大鼠購于北京維通利華實驗動物技術有限公司。大鼠試喂養1周，根據用藥時間分早期組和晚期組，早期組選用8周齡SHR大鼠，晚期組選用12周齡SHR大鼠，并設置同齡WKY組大鼠為正常對照。早期組包括當歸補血顆粒治療組（DG組，10只）和生理鹽水對照組（NS組，8只）和同齡WKY大鼠（5只）；晚期組包括當歸補血顆粒治療組（DG組，10只）和生理鹽水對照組（NS組，8只）和同齡WKY大鼠（5只）。早期DG組6 g/（kg·d）灌胃，直至28周齡；晚期組以同樣DG灌胃，直至28周齡；NS組以等量生理鹽水灌胃，WKY大鼠不做任何處理。各組大鼠血壓采用無創性尾套式大鼠血壓計監測，每周1次，在大鼠清醒狀態下測定尾動脈收縮壓，每鼠測量3次，取均值，每周測血壓兩次。測血壓前大鼠經37 ℃預熱15 min。

1.2 主要材料 當歸補血顆粒購自河南省中醫院配方顆粒藥房，選用黃芪30 g，當歸6 g；尿β2微球蛋白按照放射免疫試劑盒由中國原子能科學研究所生產；總RNA提取試劑盒（RNeasyMini Kit試劑盒）購自美國Qiangen公司，逆轉錄試劑盒購自美國Promega公司，real-time PCR試劑盒（q-PCR Mixture）購自日本TaKaRa公司，熒光探針實時定量PCR儀（ABI 7900HT）購自美國Applied Biosystems公司，real-time PCR所用引物由上海生物工程有限公司合成，羊抗CTGF多克隆抗體購自美國Abcam公司，鼠抗β-actin單克隆抗體購自美國Sigma公司，二抗均購自美國Sigma公司，增強化學發光（ECL）顯色液購自美國Pierce公司。

1.3 觀察指標及檢測方法

1.3.1 生物化學指標檢測 各組大鼠在28周齡時處死，處死前1 d，代謝籠收集24 h尿液，-20 ℃保存。處死時經心臟取血2 mL，冰上靜置10 min，加入抗凝管，3000 r/min離心5 min，取上清液。尿素氮和肌酐由HI-TACHI7150A自動生物化學分析儀檢測，尿β2微球蛋白按照放射免疫試劑盒說明書進行檢測。

1.3.2 組織病理學染色

1.3.2.1 腎臟組織HE染色 腎組織以4%多聚甲醛固定，常規包埋、切片，做HE染色觀察腎組織病理變化，每張標本低倍鏡下單盲依序觀察左上、右上、左下、右下、中間5個腎小管間質視野，依據腎小管上皮細胞空泡變性、腎小管擴張、腎小管萎縮、紅細胞管型、蛋白管型、間質水腫、間質纖維化、間質炎性細胞浸潤等8項指標來觀察腎間質病理改變并進行腎小管間質損傷指數評分[3]。

1.3.2.2 血管病變檢測及評分 腎臟組織HE染色，規定皮質區的動脈橫切面>5個，于光鏡下對不同的管徑動脈實際橫斷面總數進行計數。如果動脈管徑在30~100 μm，其中膜肌層未低于2層，則該動脈屬于小動脈；如果動脈管徑<30 μm，同時平滑肌的細胞超過一層，則該動脈屬于微動脈。借由計算機輔助病理分析系統、顯微鏡的目鏡測微尺，對動脈內膜厚度、腎內的小動脈外徑、微動脈的外徑、動脈中膜的厚度、小動脈的內徑以及微動脈的內徑等進行準確測量。

參照Katafuchi等[4]的方法，腎間質小血管病變按光鏡下的形態學特點分為4型：（1）透明變性（Hyalinosis，HL）型：動脈內膜透明樣變或玻璃樣物質沉積，可見彈力層分層，血管壁無壞死、無炎細胞浸潤，無血管內膜增厚；（2）動脈硬化（Arteriosclerosis，AS）型：動脈血管內膜增厚、管腔不同程度狹窄及彈力層分層，管壁無壞死，可伴有動脈壁透明變性；（3）炎細胞浸潤（Celluar infil-tration， CI）型：血管壁炎細胞浸潤，可伴有管壁增厚、透明樣變，無管壁壞死、內膜增厚；（4）纖維素變性壞死（Fibroid necrosis，FN）型：血管壁以纖維素樣變性和/或壞死為主要表現，可伴有管腔狹窄。

動脈壁增厚的定義為：橫斷面腎內動脈內徑<1/2外徑。

腎動脈病變的半定量分級標準：0：無損害；1：<25%；2：25%~50%；3：≥50%。

1.3.3 Real-time PCR檢測大鼠腎組織CTGF表達

1.3.3.1 組織總RNA的提取 按照用RNeasy Mini Kit試劑盒提取組織總RNA，抽提的總RNA用紫外分光光度計測OD值，比值在1.9~2.0，取3 μL RNA用1%瓊脂糖凝膠電泳，可見5、18、28 s 3條清晰的RNA帶，提示RNA無污染和降解。

1.3.3.2 cDNA的合成 按照用逆轉錄試劑盒合成cDNA，再以此cDNA為模板進行real-time PCR反應操作。Real-time PCR的引物序列如下：β-actin上游5'-GGCCAACCGTGAAAAGATGA-3'，下游5'-GACCAGAGGCATACAGGGACAA-3'；CTGF 上 游 5'-CCTGTGAAGCTGACCTAGAGGAAA-3'，下游5'-ACAGAACTTAGCCCGGTAGGTCTT-3'。

1.3.3.3 Real-time PCR檢測 在ABI 7900型熒光定量PCR儀上進行擴增，96孔板加樣，設計復孔和標準曲線，用Se-quence Detection System軟件分析各檢測樣本的Ct值（達到一定熒光閾值的循環數），計算2-△△Ct評價TGF-β及CTGF在腎組織中的表達水平。

1.3.4 Western Blot檢測腎組織CTGF蛋白表達

1.3.4.1 腎皮質總蛋白質的提取 取組織塊100 mg加入組織總蛋白提取液1 mL勻漿，冰上裂解30 min，4 ℃以12 000 r/min離心15 min，取上清，按Bio-rad蛋白定量試劑盒方法進行蛋白定量，取80 μL上清加5×變性緩沖液20 μL混勻，100 ℃下變性10 min。

1.3.4.2 免疫印跡檢測 灌制10%的分離膠和4%的堆積膠，取總蛋白100 μg行上樣電泳，電泳結束后260 mA電轉印90 min至PVDF膜。封閉液（5%牛奶）搖床上封閉2 h，加入羊抗CTGF多克隆抗體（1∶200），4 ℃搖床過夜。洗膜后再加相應的二抗，室溫孵育1 h，加ECL液后顯影、定影，以β-actin為內參照。將膠片掃描后，采用Quantity One軟件分析各條帶灰度值，將各目的條帶灰度值除以同一標本內參照β-actin條帶灰度值得到一比值，將該比值除以同一膠片上假手術組的比值作為該目的蛋白表達量的半定量結果。

1.4 統計學處理 采用SPSS 17.0軟件進行分析，計量資料采用（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠血壓、血肌酐、尿素氮和尿β2微球蛋白（β2MG）水平比較 SHR血壓較WKY大鼠明顯升高，差異有統計學意義（P<0.05）。經治療后，DG組大鼠血壓較NS組差異無統計學意義（P>0.05），說明DG無降壓作用。早期組治療后，DG組血肌酐、尿素氮和尿β2MG水平均較NS明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05）。晚期組治療后，DG尿β2MG與NS比較，差異有統計學意義（P<0.05）；DG組血肌酐、尿素氮與NS比較，有下降趨勢但差異無統計學意義（P>0.05），見表 1。

表1 各組大鼠治療前后各項指標的比較（x-±s）

2.2 腎間質纖維化和血管病變評分 SHR腎間質損害及血管病變較WKY大鼠明顯增加，差異有統計學意義（P<0.05）；經治療后，DG組大鼠腎間質損害及血管病變均較NS組明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05）；早期組經DG治療后，間質纖維化和血管病變程度均較生理鹽水對照組明顯好轉，差異有統計學意義（P<0.01），治療效果優于晚期組，各組比較見表2。

2.3 各組大鼠治療前后腎組織CTGF mRNA和蛋白表達 SHR腎組織CTGF mRNA和蛋白表達均較WKY大鼠明顯增加，差異有統計學意義（P<0.05）；晚期組經治療后，DG組大鼠腎間質損害及血管病變均較NS組明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05）；早期組經DG治療后，間質纖維化和血管病變程度均較NS組明顯好轉，差異有統計學意義（P<0.01），治療效果優于晚期組，見表2、圖1。

表2 各組大鼠治療前后腎間質纖維化和血管病變評分比較（x-±s） 分

表3 各組大鼠治療前后CTGF mRNA和蛋白表達情況比較（x-±s）

圖1 各組大鼠治療前后腎組織CTGF mRNA和蛋白表達注：1：WKY大鼠；2：早期DG組；3：早期NS組；4：晚期DG粒組；5：晚期NS組

3 討論

高血壓腎損害主要表現為血管的損害和間質纖維化，血管損害典型病理表現為腎小動脈的肌內膜肥厚和/或細小動脈的玻璃樣變。高血壓造成的壓力改變，引起肌型小動脈內膜膠原纖維及彈力纖維增生，內彈力膜分裂，中膜平滑肌細胞增生肥大，同時伴纖維組織增生，造成血管壁增厚，管腔狹窄。高血壓造成的細動脈反復痙攣，內皮細胞受損，內皮間隙擴大，血漿蛋白滲入內皮下間隙；同時內皮細胞及中膜平滑肌細胞分泌細胞外基質增多、平滑肌凋亡，最終管壁被上述物質替代，發生細小動脈玻璃樣變，進而導致腎小球及腎小管的缺血性改變，后期表現為腎小球廢棄性或固化性硬化，以及腎小管萎縮及間質纖維化。

CTGF是TGF-β1促纖維化作用的重要下游介質，在人體心、腦、肺、肝、腎、肌肉、胎盤、結締組織中均有表達，可抑制細胞外基質（Extracellular Matrix，ECM）降解，促進ECM生成、沉積，并可通過促進細胞有絲分裂、增殖來誘導、刺激成纖維細胞活化、增殖[5-7]。CTGF在許多疾病的致纖維化作用中介導了TGF-β1的許多功能。但是TGF-β1的生物學作用廣泛，阻斷TGF-β1可能會影響重要功能而產生不良反應，而對下游的因子，如CTGF阻斷和干預，則更具特異性。

當歸補血湯是一首來自金元時代李東垣《內外傷辯惑論》的經典益氣補血方劑，由黃芪和當歸兩味藥以5：1比分組成。該方在配伍時重用黃芪大補脾腎之氣，以資氣血生化之源，配以當歸苷辛而溫，養血和營，黃芪為君，當歸為臣，目前臨床上多使用當歸補血顆粒。黃芪甲苷是黃芪的主要成分之一，是評價黃芪藥材質量的優劣標準，有抑制腎間質纖維化的作用[8]；阿魏酸為非胍類內皮素受體拮抗劑，是當歸的主要有效成份之一，為其活血成分的主要物質基礎，阿魏酸具有抗血小板聚集、抗炎、抗氧化、抗纖維化的作用。

黃芪當歸配伍有明確的科學依據。黃芪甲苷難溶于水，生物利用度差，而阿魏酸能明顯促進黃芪甲肝在大鼠十二指腸的吸收作用[9]。芪歸配比5：1組阿魏酸析出比例最高，大鼠免疫功能及抗炎能力改善影響最大[10-12]。

SHR的血壓升高是由多基因遺傳決定的，與人類高血壓病十分類似，SHR出生后血壓隨鼠齡不斷升高，3~4個月時為高血壓確立期，6個月時血壓升到最高水平，幼年SHR交感活性增高，隨血壓升高進一步出現心、腦、腎等并發癥。本研究選用8周為SHR大鼠早期干預點，這時SHR血壓已開始升高但尚未出現明顯并發癥；選用12周為晚期干預點，這時SHR血壓已經出現明顯升高，各種并發癥開始出現。

本研究發現，當歸補血顆粒早期干預能明顯降低SHR血肌酐和尿素氮水平、減少尿β2MG水平，改善高血壓腎間質纖維化程度和腎血管病變程度，當歸補血顆粒的這一作用與降低腎組織CTGF mRNA和蛋白表達相關，早期用藥效果優于晚期；當歸補血顆粒對大鼠血壓無影響，說明當歸補血顆粒治療作用與血流動力學無關。當歸補血顆粒能通過早期干預CTGF表達緩解高血壓腎損害腎血管病變和間質纖維化水平。本研究為當歸補血顆粒在高血壓腎損害早期治療方面的臨床應用提供了試驗參考。

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