銀杏內酯B對視神經鉗夾傷后大鼠視網膜神經節細胞的保護作用*

鄭幼平 吳小桃 田原 張曉明 周小娟 孟晶

青光眼是世界第二位致盲性眼病，是一種威脅視神經視覺功能的眼病，具體發病機制尚不清楚。一般認為視神經損傷后視網膜神經節細胞（retinal ganglion cells，RGCs）是以細胞凋亡的形式減少，尋找有效藥物減輕或延遲視神經損害，是研究視神經損傷的一個主要方面[1-3]。銀杏內酯B（ginkgolide B，GB）是銀杏葉提取物中主要的活性成分。前期研究證實GB能夠上調Bcl-2/Bax比值，從而降低細胞內Ca2+濃度，實現保護體外培養的視網膜神經細胞作用，并對N-甲基-N-亞硝脲（N-methyl-N-nitrosourea，MNU）誘導的實驗性大鼠視網膜變性所致的視網膜光感受器細胞損傷和視功能損害具有抑制作用[4-6]。為進一步探討銀杏內酯B對大鼠視神經鉗夾傷后視網膜神經節細胞（RGCs）的保護作用進行了本研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取出生46 d的SD大鼠（中山大學實驗動物中心提供）36只，雌雄不拘。全部飼養于標準鼠籠中，維持12 h白晝，12 h夜晚時間周期。

1.2 視神經鉗夾傷建模方法 以1%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，按Nakazawa等[7]的方法暴露視神經；剪開外眥角，沿角膜緣外1 mm剪開球結膜，向后鈍性分離暴露視神經。用頭部寬1 mm，長18 mm的微血管止血鉗（上海醫療器械有限公司）夾持10 s，直接檢眼鏡觀察視網膜，視網膜無缺血性改變者為成功模型；縫合球結膜和外眥角，涂金霉素眼膏。術中注意盡可能鈍性分離球后筋膜組織并避開血管，減少對眼球血液供應的影響，同時注意原位操作，盡可能減少對視神經的牽拉。

1.3 處理方法 A組（正常對照組）不經任何處理；B組（模型組）、C組（GB治療組）大鼠暴露并鉗夾視神經；B組實驗前1周每日腹腔注射NS，容積參照GB的劑量（40 mg/kg），造模后繼續腹腔注射NS直至處死。C組實驗前1周腹腔注射GB 40 mg/kg（廣州市藥檢所提供），于造模后繼續腹腔注射1周直至處死。三組分別在術后1周，F-VEP檢查后隨機處死大鼠行HE染色光鏡檢查，每組各4只，其余2周后作RGCs計數。

1.4 閃光視覺誘發電位（F-VEP）每組隨機抽取8只大鼠，采用BIO-2000型視覺電生理檢查系統（重慶貝澳電子儀器有限公司）檢查閃光視覺誘發電位（flash visual evoked potentials，F-VEP）。檢查時關閉照明，暗適應10 min后，進行雙眼F-VEP采集。背景參數：Ganzfeld閃光刺激器，光強為10 db，刺激頻率為1.9 Hz單閃刺激模式，波形疊加80次，閾值設定為50 mV。主要觀察AP1（N1-P1振幅）和LP1（P1波潛伏期），振幅的大小以微伏（μV）為單位，潛伏期以毫秒（ms）為單位，Nl谷底至Pl頂峰為Nl-Pl的振幅值（AP1），起始至P1頂峰的時間為P1峰潛伏期（LP1）。實驗數據為3次測量的平均值。

1.5 組織切片制作及RGCs計數 三組分別在造模后1周，F-VEP檢查后隨機處死大鼠，A、B、C組各4只。造模后2周，處死所有大鼠。在角膜緣12：00位縫線作標記并摘取眼球。立體解剖顯微鏡下去除眼前節和晶狀體后放入4%多聚甲醛溶液中固定過夜，沿縱軸將眼球兩邊開窗，組織脫水后行石蠟包埋，選取包含視神經的縱切面，沿12：00-6：00經線并沿視神經中央對剖開眼球，連續切片（切片厚度4 μm），行蘇木精-伊紅（HE）染色。400倍放大倍率的視野顯微鏡下，從12：00-6：00鋸齒緣（經視盤中央），計數整個經線上的RGCs，取其平均值。

1.6 統計學處理 利用統計學軟件SAS 6.12對數據進行處理，計量資料采用（x-±s）表示，多組間比較行方差分析，兩兩比較行t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組光學顯微鏡觀察結果 A組HE：神經纖維層較厚，RGCs呈立方形，排列緊密，胞漿豐富，胞核飽滿且染色較均勻，神經膠質細胞較少（圖1、2）；B組HE：神經纖維層極薄，RGCs稀少，同時神經膠質細胞明顯增多（圖3、4）；C組HE：RGCs胞體大小正常，數目較正常略少，視神經損傷后2周，神經纖維層輕度變薄（圖5、6）。

2.2 三組RGCs數的比較 視神經損傷2周，垂直經線上RGCs計數結果為A組（281±39）個，B組（112±20）個，C組（228±35）個，A、B、C三組間比較差異有統計學意義（P<0.05）。

圖1 A組視神經損傷后1周的大鼠視網膜形態（HE×400）

圖4 B組視神經損傷后2周的大鼠視網膜形態（HE×400）

圖2 A組視神經損傷后2周的大鼠視網膜形態（HE×400）

圖5 C組視神經損傷后1周的大鼠視網膜形態（HE×400）

圖3 B組視神經損傷后1周的大鼠視網膜形態（HE×400）

圖6 C組視神經損傷后2周的大鼠視網膜形態（HE×400）

2.3 三組視神經損傷后1周和2周時的F-VEP比較 視神經損傷后1周，B組較A、C組LPl波延長、AP1降低（P<0.05），C組與A組LP1、AP1比較差異無統計學意義（P>0.05）。視神經損傷后2周，B組的LPl較前1周進一步延長，AP1進一步降低，A、B、C三組LPl、AP1比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見表1、圖7。

表1 三組視神經損傷后1周和2周時的閃光視覺誘發電位（±s）

表1 三組視神經損傷后1周和2周時的閃光視覺誘發電位（±s）

*與A組比較，P<0.05；△與B組比較，P<0.05

視神經損傷后2 周組別 視神經損傷后1 周AP1（μV）LP1（ms）AP1（μV）LP1（ms）A 組（n=8）19±3 90±4 21±3 92±11 B 組（n=8）11±3* 110±6* 7±2* 186±15*C組（n=8）18±2△ 94±4△ 14±3*△ 104±12*△F值 20.73 23.17 53.45 128.19 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

圖7 視神經損傷后1周和2周時的F-VEP注：左側為損傷后1周，右側為損傷后2周；上、中、下依次為A、B、C組

3 討論

視神經鉗夾傷后，RGCs經歷機械性損傷的快速死亡階段，剩余存活RGCs發生類似于青光眼視神經病變的慢性損傷過程[8-9]。Dezawa等[10]研究認為視神經損傷后RGCs退化的快與慢，存活時間的長與短，和RGCs軸突的再生潛力有直接的關系，存活時間越長，其再生潛力越大。視神經損傷后，若能夠采取積極有效的治療措施減少和延緩RGCs在細胞快速喪失期的退變，就可能會明顯提高視神經功能的恢復[11-12]。

術后1周和術后2周的大鼠視網膜組織HE染色切片，光學顯微鏡下觀察可見：正常對照組神經纖維層較厚，RGCs呈立方形，排列緊密，胞漿豐富，胞核飽滿且染色較均勻，神經膠質細胞較少；模型組神經纖維層變得極薄，RGCs胞體減小，數目稀少，同時神經膠質細胞明顯增多；GB治療組術后1周，神經纖維層厚度基本正常，RGCs胞體大小正常，數目較正常略少，術后2周，神經纖維層輕度變薄。模型組視神經鉗夾傷后，RGCs形態和數量均明顯受損。而GB治療組與模型組比較，RGCs胞體大小正常，數目僅輕度減少。應用術后2周的大鼠視網膜組織HE染色切片，400倍的光學顯微鏡下直接計數各組大鼠視網膜整個垂直經線上（12：00-6：00）經視盤中央的RGCs數目：正常對照組（281±39）個，模型組（112±20）個，GB治療組（228±35）個。模型組RGCs數目較正常組明顯減少，而GB治療組RGCs數目明顯優于模型組。以上研究結果初步證明GB能改善視神經鉗夾傷后RGCs存活數量和時間。

F-VEP是以閃光刺激視網膜在大腦枕葉皮層而誘發的一組電信號，反映視覺信息在視路中傳導的總體情況，是客觀評價視功能的重要參考指標[13]。主要觀察指標為主波的潛伏期及幅值，潛伏期的長短反應髓鞘的器質完整性和功能狀態，振幅的高低反應軸索的功能狀態[14]。正常視神經纖維在篩板后有髓鞘，其神經沖動的傳導為跳躍式；視神經損傷時，髓鞘變性脫落，潛伏期延遲且振幅降低[15]。

本研究F-VEP的測定中采用全視野單閃刺激模式，刺激的強度和頻率易于控制。結果顯示，視神經損傷后1周，A、B、C三組的Pl波的潛伏期和振幅分別 為 [（90±4）ms，（19±3）μV]、[（110±6）ms，（11±3）μV]和 [（94±4）ms，（18±2）μV]； 視 神經損傷后2周，A、B、C三組的Pl波的潛伏期和振幅分別 為 [（92±11）ms，（21±3）μV]、[（186±15）ms，（7±2）μV] 和 [（104±12）ms，（14±3）μV]。證明GB能有效緩解視神經鉗夾傷后引起的大鼠視功能的損傷。F-VEP結果與各組大鼠視網膜形態學改變相符合，說明腹腔注射銀杏內酯B能部分抑制大鼠視神經鉗夾后RGCs凋亡，具有一定的RGCs保護作用，并能部分緩解視功能的損傷。有關GB對RGCs功能的保護作用及機制將進一步深入研究。

[1] Weinmann S，Ron S，Schwarzbach C.Effects of Ginkgo biloba in dementia：systematic review and meta-analysis[J].BMC Geriatrics，2010，3（17）：10-14.

[2] 官堂明，黃家園，黃潔浩，等.銀杏葉提取物防治神經系統疾病的臨床研究進展[J].中國老年醫學雜志，2012，11（32）：5078-5081.

[3] 朱翠萍.銀杏葉治療視網膜震蕩38例療效觀察[J].中國醫學創新，2011，8（6）：61-62.

[4] 孟晶，唐仕波，林少芬，等.銀杏苦內酯B 對體外培養的大鼠視網膜神經細胞凋亡的影響[J].中國病理生理雜志，2006，22（2）：791-795.

[5] 孟晶，唐仕波，林少芬，等.銀杏內酯B對N-甲基-N-亞硝脲誘導的大鼠視網膜變性的保護作用[J].眼科研究，2006，24（4）：340-343.

[6] 孟晶，丁小燕，朱曉波，等.銀杏苦內酯B 對體外培養的視網膜神經細胞內鈣離子濃度和線粒體功能的影響[J].中國病理生理雜志，2009，25（11）：2192-2196.

[7] Nakazawa T，Tamai M，Mori N.Brain-derived neurotrophic factor prevents axotomized retinal ganglion cell death through MAPK and PI3K signaling pathways[J].Invest Ophthalmol Vis Sci，2002，43（10）：3319-3326.

[8] Ma K，Xu L，Zhang H，et al.The effect of ginkgo biloba on the rat retinal ganglion cell survival in the optic nerve crush model[J].Acta Ophthalmol，2010，88（5）：553-557.

[9] Ma K，Xu L，Zhan H，et al.Dosage dependence of the effect of Ginkgo biloba on the rat retinal gangli on cell survival after optic nerve crush[J].Eye （Lond），2009，23（7）：1598-1604.

[10] Dezawa M，Kawana K，Negishi H，et al.Glial cells in degenersting and regeneranting optic nerve of the adult rat[J].Brain Res Bun，1999，48（6）：573-579.

[11] Cybulska-Heinrich A K，Mozaffarieh M，et al.Flammer Ginkgo biloba：an adjuvant therapy for progressive normal and high tension glaucoma[J].Mol Vis，2012，18（2）：390-402.

[12] Cheung Z H， Leung M C，Yip H K，et al.A neuroprotective herbal mixture inhibits caspase-3-independent apoptosis in retinal ganglion cells[J].Cell Mol Neurobiol，2008，28（1）：137-155.

[13] Yan H，Li F，Zhang L.A new and reliable animal model for optic nerve injury[J].Curr Eye Res，2012，37（10）：941-948.

[14] Huo Y，Yin X L，Ji S X，et al.Amino-Nogo inhibits optic nerve regeneration and functional recovery via the integrin αv signaling pathway in rats[J].Cell Physiol Biochem，2015，35（2）：616-626.

[15] Holmes M D，Sires S B.Flash visual evoked optic neuropathy[J].Ophthalmol Plast Reconstru Surg，2004，20（5）：342-346.