基因修飾的骨髓間充質干細胞移植對大鼠急性心肌梗死的療效觀察*

熊永泉 陸東風 何志裕

隨著我國科技及醫療水平的不斷發展，細胞性心肌成形術不斷發展，已經成為冠心病和心力衰竭治療、研究的熱點，為終末期心臟病患者的治療帶來了新的希望。為進一步研究骨髓間充質干細胞移植對急性心肌梗死細胞的治療作用，本研究以大鼠模型為觀察對象進行研究，旨在為臨床應用骨髓間充質干細胞移植提供理論依據，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 選取15 d齡SD乳鼠20只，體質量（210±45） g。

1.2 試劑和儀器 血管內皮生長因子165、磷酸鹽、0.2 g/L乙二胺四乙酸、0.5 g/L胰蛋白酶、甲醛（體積分數10%）、小量質粒抽提試劑盒、jet-PEI 細胞轉染試劑盒、CM-DiI（Cell TrackerTM C-7001）、DMEM低糖培養基（含10 000u肝素）、HP/Sonos 5 500，7.5 MHz探頭、ElivisionTM plus兩步試劑盒

1.3 方法

1.3.1 急性心肌梗死動物模型的制備 本研究模型制備的方法為：首先麻醉大鼠，本研究選用的麻醉方式為腹腔注射麻醉，麻醉藥選用1%的戊巴比妥鈉40~50 mg/kg。麻醉成功后，需氣管插管，并連接呼吸機輔助呼吸。前期工作完成后，進入模型制備階段，助手常規消毒鋪單后，由本研究統一研究人員進行手術操作，具體操作步驟如下：首先，于大鼠距胸骨左側約0.5 cm處沿3、4肋間作縱形切口，逐層剝離后進入胸腔，將心臟充分暴露于手術視野，然后于左心耳下緣與肺動脈圓錐之間距主動脈根部2.0~3.0 mm處，結扎大鼠左冠狀動脈前降支，結扎完成后，觀察結扎區域是否變白，局部心肌是否運動減弱，以確定是否結扎成功，本研究選用的判定標準為兩個以上肢體導聯或胸導出現ST段抬高0.2 mV以上。

1.3.2 骨髓間充質干細胞的提取、培養 將大鼠處死后，于無菌條件下分離大鼠股骨和脛骨，剔除肌肉、骨膜，剪一側骨端。本研究選用10 mL無血清DMEM低糖培養基（含10 000u肝素）將大鼠股骨和脛骨內的骨髓細胞沖出，將沖出的液體收集后制成單細胞懸液，濾去骨渣及碎肉組織，將剩余液體放置于離心管中，并以1500 r/min的速度，于20 ℃的環境下進行離心，離心時間為5 min，完成后棄上清液，加入含體積分數為0.1胎牛血清的DMEM低糖培養基中重懸，然后將細胞懸液注入預先加有密度為1.073的細胞分離液的試管中，并以2000 r/min的速度，于20 ℃的環境下進行離心，離心時間為30 min。離心結束后，取中間的細胞層，再用磷酸鹽緩沖液清洗2次后進行原代培養，在培養過程中，觀察到骨髓間充質干細胞80%貼滿培養瓶底時進行傳代消化，本研究采用的方法為：0.2 g/L的乙二胺四乙酸和0.5 g/L的胰蛋白酶按1∶1比例混合進行，傳代后繼續培養。1.3.3 血管內皮生長因子轉染骨髓間充質干細胞方法 本研究采用pcDNA3.1（-）/h血管內皮生長因子165對骨髓間充質干細胞進行轉染。按上述步驟消化、離心骨髓間充質干細胞后，按105接種于6孔培養板，按jet-PEI試劑盒說明書操作步驟對其進行轉染。

1.3.4 骨髓間充質干細胞的標記方法 本研究選用CM-DiI溶液進行標記，運用0.01 mmol/L D-PBS將質量濃度為2 g/L的CM-DiI溶液稀釋至2 μmol/L，取生長良好的三、四代細胞，用0.01 mmol/L D-PBS洗滌3次，于37 ℃的環境下加入濃度為2 μmol/L 的CM-DiI，在4 ℃的環境下于體積分數5% CO2的孵箱內孵育15 min。

1.3.5 細胞移植方法 將本研究大鼠分為兩組，分別為觀察組（血管內皮生長因子組）和對照組（DMEM組），每組10只大鼠。將用CM-DiI標記的骨髓間充質干細胞進行消化離心，按5×106重懸浮，觀察組大鼠在缺血區邊緣分4點注射細胞懸液40 μL，對照組大鼠注射無血清DMEM 40 μL，注射部位和方式均與觀察組大鼠相同，注射完成后逐層關胸，待大鼠自主呼吸完全恢復后脫機拔管。

1.4 觀察指標

1.4.1 大鼠的大體心臟功能 于細胞成功移植后1個月，麻醉大鼠，采用的麻醉方式為腹腔麻醉，麻醉藥采用巴比妥鈉麻醉，劑量為30 mg/kg，將大鼠仰臥位固定于解剖臺，運用HP/Sonos 5 500，7.5 MHz探頭檢查。計算大鼠左室收縮末期容積和舒張末期容積，并計算出左室射血分數=（左室舒張末期容積-左室收縮末期容積）/左室舒張末期容積。

1.4.2 蘇木精-伊紅染色 移植后1個月，麻醉大鼠，尾靜脈注入高鉀液及肝素，迅速取出心臟，PBS漂洗、固定、石蠟包埋、切片、脫水后行蘇木精-伊紅染色，光鏡下觀察其病理變化。

1.4.3 新生血管密度 對心臟標本病理切片，行Ⅷ因子染色，每只大鼠取5張切片，分別在每個切片梗死區周邊隨機選擇5個視野，計數毛細血管數目。

1.5 統計學處理 使用SPSS 19.0統計軟件進行分析處理，計量資料用（x-±s）表示，比較采用t檢驗，計數資料采用字2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組大鼠左心室功能比較 觀察組與對照組大鼠LVEF分別為（73.45±9.17）%、（43.26±6.33）%，觀察組明顯高于對照組，兩組比較差異有統計學意義（P<0.05）。

2.2 兩組大鼠蘇木精-伊紅染色結果比較 兩組大鼠鏡下均見左室瘢痕組織形成，有新生血管生成，并出現左室重塑特征，觀察組大鼠心臟改變較對照組明顯，見圖1~2。

圖1 觀察組大鼠鏡下結果

圖2 對照組大鼠鏡下結果

2.3 兩組大鼠血管再生情況比較 觀察組大鼠與對照組大鼠血管密度分別為（45.69±4.28）、（17.41±3.67），觀察組明顯高于對照組，兩組比較差異有統計學意義（P<0.05）。

3 討論

隨著我國科技及醫療水平的不斷發展，細胞性心肌成形術不斷發展，已經成為冠心病和心力衰竭治療、研究的熱點，為終末期心臟病患者的治療帶來了新的希望[9-11]。骨髓干細胞移植的優勢在于其取材簡便，從自體采集，避免了胚胎干細胞所面臨的倫理學糾紛和免疫排斥反應，且可形成有效的電—機械耦聯，彌補了骨骼肌干細胞的不足，因此骨髓干細胞是最具優勢的移植細胞來源[12-13]。

本研究運用血管內皮生長因子基因修飾的骨髓間充質干細胞移植對急性心肌缺血大鼠進行干預，結果顯示：觀察組大鼠左心室功能、血管再生情況、鏡下左心室病理改變均明顯優于對照組，提示，骨髓干細胞移植的有效性。血管內皮生長因子是一種最重要的成血管因子，其主要作用在于調節內皮細胞外基質溶解、遷移、增生和管腔形成、刺激多種細胞增殖，延緩衰老，抑制凋亡，改善存活等，促進血管生成[14]。

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