鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)蛋白1在痛性糖尿病神經(jīng)病變大鼠脊髓背角的表達(dá)變化*

劉文捷，郭曲練，何萬(wàn)友，彭良玉

（1.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院 麻醉科，湖南 衡陽(yáng)421001；2.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院 麻醉科，湖南 長(zhǎng)沙410008；3.廣東省佛山市第一人民醫(yī)院 麻醉科，廣東 佛山528000）

隨著糖尿病發(fā)病人數(shù)的逐年增加[1-3]，痛性糖尿病神經(jīng)病變（painful diabetic neuropathy，PDN）作為糖尿病最常見(jiàn)的并發(fā)癥，成為危害公眾身體健康及生活質(zhì)量最嚴(yán)重的問(wèn)題之一[4-5]。PDN常表現(xiàn)為痛覺(jué)敏化、異常痛和自發(fā)痛，其中痛覺(jué)敏化是PDN的主要病理機(jī)制。痛覺(jué)敏化的形成涉及多種細(xì)胞因子、遞質(zhì)、受體、離子通道和核內(nèi)第三信使的表達(dá)，是感覺(jué)神經(jīng)元到脊髓神經(jīng)元突觸敏感性和興奮性增強(qiáng)的過(guò)程。細(xì)胞內(nèi)外鈣離子濃度的動(dòng)態(tài)平衡是神經(jīng)元細(xì)胞保持正常興奮性的有力保證之一。研究發(fā)現(xiàn)糖尿病可以通過(guò)降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子含量，破壞感覺(jué)神經(jīng)元內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子穩(wěn)態(tài)，從而干擾神經(jīng)元鈣離子信號(hào)的形成、放大、傳播和終止。

鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)蛋白1（calcium homeostasis modulator 1，CALHM1）作為存在于神經(jīng)元細(xì)胞膜或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的新型鈣離子通道，受膜電壓及細(xì)胞外鈣離子濃度的雙重調(diào)控[6]。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞外鈣離子濃度降低能激活CALHM1，其被激活后會(huì)增加細(xì)胞膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子的通透性；同時(shí)還通過(guò)降低鈣離子的轉(zhuǎn)運(yùn)能力和肌漿網(wǎng)/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子—ATP酶（sarco/endoplasmic calcium transporting AT-Pase，SERCA）對(duì)鈣的親和力，減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對(duì)鈣離子的再攝取[7]，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度急劇升高，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的鈣離子含量急劇減少，細(xì)胞內(nèi)外鈣離子的穩(wěn)態(tài)被破壞，從而誘發(fā)細(xì)胞興奮性增高和未折疊蛋白反應(yīng)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。因此，筆者假設(shè)CALHM1被激活后出現(xiàn)的細(xì)胞內(nèi)外鈣離子濃度失衡很可能是PDN發(fā)生的重要原因之一。本實(shí)驗(yàn)主要研究CALHM1在PDN大鼠模型脊髓背角神經(jīng)元上的表達(dá)，為更好地治療PDN提供一個(gè)可能的治療靶點(diǎn)和新思路。

1 材料與方法

60只健康雄性2月齡Sprague-Dawley大鼠，體重180～200 g，采用隨機(jī)分組方法（隨機(jī)數(shù)字表法）將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為對(duì)照組（C組）和模型組（D組），每組30只。C組腹腔注射生理鹽水1.2ml，D組腹腔注射1%鏈尿佐菌素（streptozotocine，STZ）60mg/kg。建模后48 h血糖>16.7mmol/L視為建模成功。分別于建模前及建模后1、2、3、4、5和6周，采用Von Frey絲測(cè)定大鼠縮足反應(yīng)閾值（paw withdraw threshold，PWT）。

1.1 標(biāo)本制備

1.1.1 免疫組織化學(xué)標(biāo)本制備 建模成功后第6周，將兩組各10只實(shí)驗(yàn)大鼠予以10%水合氯醛400 mg/kg腹腔注射麻醉后，剖開(kāi)胸腔經(jīng)心臟插管，以4℃的4%多聚甲醛300～400ml灌注固定后，取出腰段膨大處脊髓組織，置于4%多聚甲醛固定液，梯度酒精脫水，二甲苯進(jìn)行透明處理，石蠟制成蠟塊，切片備用。

1.1.2 W estern blot和實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增反應(yīng)（qRT-PCR）檢測(cè)標(biāo)本制備 建模成功后第6周，將兩組各20只實(shí)驗(yàn)大鼠予以10%水合氯醛400mg/kg腹腔注射麻醉后，放置在冰上迅速解剖分離腰脊髓膨大，置于防凍EP管中，于液氮中保存待用。

1.2 免疫組織化學(xué)

將免疫組織化學(xué)標(biāo)本的蠟塊切片至5μm，在恒溫水浴箱將切片平整展開(kāi)，攤片至玻片，并置于37℃烤箱中烤片過(guò)夜。經(jīng)過(guò)2次100%二甲苯脫蠟后，按SP超敏二步法染色，抗CALHM1（ab106561）濃度為1∶100，干燥后用中性樹膠封片，最后在顯微鏡下拍片觀察各組脊髓背角CALHM1的表達(dá)。選取脊髓背角（I、Ⅱ板層）計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞率，陽(yáng)性細(xì)胞率（%）=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.3 Western blot檢測(cè)

將兩組各10只實(shí)驗(yàn)大鼠的標(biāo)本自液氮罐中取出，并研磨組織至單細(xì)胞狀態(tài)，每10 mg組織加入200μl裂解液（含PMSF），冰上裂解30 min；4℃、12 000 r/min離心15min，將上清分裝于EP管中，考馬斯亮藍(lán)G250測(cè)定蛋白質(zhì)溶液的OD值，調(diào)整樣品的蛋白濃度。采用不連續(xù)系統(tǒng)蛋白質(zhì)SDS-PAGE，濃度為12%的分離膠，總蛋白上樣量40～60μg/孔，Bio-Rad的標(biāo)準(zhǔn)濕式轉(zhuǎn)膜裝置及PVDF膜，轉(zhuǎn)膜恒壓70V，根據(jù)目的蛋白分子量選擇40min，然后立即洗去膜上的轉(zhuǎn)膜液，加入5%脫脂奶粉封閉液。1∶500（CALHM1）稀釋一抗。將PVDF膜放入含一抗溶液中，4℃孵育一抗過(guò)夜，然后按照1∶5 000稀釋辣根過(guò)氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP）標(biāo)記的二抗。將PVDF膜加入稀釋好的二抗。使用Beyo ECL Plus化學(xué)發(fā)光試劑，黑暗處顯色，用X光片壓片，顯影液及定影液洗片。Band Scan圖像分析系統(tǒng)對(duì)區(qū)帶進(jìn)行掃描分析。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測(cè)

將兩組各10只實(shí)驗(yàn)大鼠的標(biāo)本自液氮罐中取出，在培養(yǎng)板中加入裂解液MZ裂解細(xì)胞，2 100 r/min（400×g）離心5min取細(xì)胞，棄上清液。加入1m l裂解液MZ，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離，然后再4℃、12 000 r/min（13 400×g）離心5min，取上清液，加入200μl氯仿，室溫放置5min。再4℃、12 000 r/min（13 400×g）離心15 min，樣品分3層：黃色的有機(jī)相、中間層和無(wú)色的水相。RNA主要在水相中，水相的體積約為所用裂解液MZ試劑的50%。把水相轉(zhuǎn)移到新管中，緩慢加入轉(zhuǎn)移液體積0.43倍的無(wú)水乙醇，混勻（此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)沉淀）。將得到的溶液和沉淀一起轉(zhuǎn)入吸附柱miRspin，室溫12 000 r/min（13 400×g）離心30 s，若一次不能將全部溶液和沉淀加入吸附柱miRspin，就分二次轉(zhuǎn)入，離心后棄掉吸附柱miRspin，保留流出液。緩慢加入流出液體積0.75倍的無(wú)水乙醇，混勻轉(zhuǎn)入吸附柱miRelute，室溫12 000 r/min（13 400×g）離心30 s，保留吸附柱miRelute。加入500μl去蛋白液MRD，室溫靜置2 min，室溫12 000 r/min（13 400×g）離心30 s，棄廢液。向吸附柱miRelute加入600μl漂洗液RW，室溫靜置2min，室溫12 000 r/min（13 400×g）離心30 s，棄廢液。將吸附柱miRelute轉(zhuǎn)入一個(gè)新的RNase-Free 1.5m l離心管中，加15～30μl RNase-Free ddH2O，室溫放置2min，室溫12 000 r/min（13 400×g）離心2min。逆轉(zhuǎn)錄步驟按照TaKaRa Prime ScriptⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit（D6210A）試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，根據(jù)目的基因的種屬及名稱，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)查詢參考核苷酸序列，采用Primer 3.0設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物，引物序列經(jīng)NCBI nBlast比對(duì)無(wú)非特異性擴(kuò)增，用于qRT-PCR實(shí)驗(yàn)。Real Time PCR的擴(kuò)增曲線和熔解曲線采用Bio-Rad CFX96 Real-Time PCR System的操作方法。運(yùn)用Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀配套的Bio-Rad CFX Manager Software 1.6分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，且采用2-ΔΔCt法計(jì)算。實(shí)驗(yàn)?zāi)康幕蛞镄蛄校?'-3'）見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康幕蛞镄蛄校?'-3'）

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間均數(shù)比較用非獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的ANOVA，相關(guān)性分析用Pearson檢驗(yàn)；所有數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組動(dòng)物建模前后體重及血糖比較

兩組大鼠在腹腔注射STZ前及注射后第1、2、3、4和5周進(jìn)行體重測(cè)量。建模前和建模后第1周兩組體重比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；建模后第2、3、4和5周測(cè)量體重C組大鼠體重上升幅度大于D組大鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見(jiàn)

表2 兩組動(dòng)物建模前后體重比較 （g，±s）

表2 兩組動(dòng)物建模前后體重比較 （g，±s）

組別 建模前 建模后1周 建模后2周 建模后3周 建模后4周 建模后5周C組 211.73±14.92 239.20±14.12 281.86±10.27 339.24±12.48 377.13±16.34 425.11±11.78 D組 212.21±14.86 228.10±10.75 237.13±11.82 242.92±8.69 256.97±13.63 268.83±7.82 P值 0.768 0.142 0.004 0.000 0.000 0.000

2.2 兩組動(dòng)物建模前后血糖比較

2.3 各組大鼠行為學(xué)測(cè)試

比較兩組實(shí)驗(yàn)大鼠在機(jī)械痛刺激下50%PWT的變化，建模前及建模后第1周兩組大鼠的50%PWT比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），從建模后第2周開(kāi)始至第6周，D組大鼠的50%PWT均顯著低于C組大鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見(jiàn)表4。

2.4 各組脊髓背角免疫組織化學(xué)檢測(cè)

兩組大鼠在建模前及建模成功后第1、2、3、4和5周抽尾靜脈血檢測(cè)空腹血糖。兩組大鼠建模前空腹血糖比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；D組建模后第1、2、3、4和5周的空腹血糖均明顯高于同時(shí)間的C組（P<0.01）。見(jiàn)表3。

表3 兩組大鼠建模前后空腹血糖比較 （mmol/L，±s）

表3 兩組大鼠建模前后空腹血糖比較 （mmol/L，±s）

組別 建模前 建模后1周 建模后2周 建模后3周 建模后4周 建模后5周C組 5.11±0.63 5.24±0.42 5.23±0.71 5.34±0.41 5.02±0.53 5.07±0.58 D組 5.04±0.51 19.79±1.08 22.27±1.09 25.32±0.93 27.68±1.26 28.52±1.03 P值 0.538 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

表4 兩組大鼠建模前后50%PWT值比較 （g，±s）

表4 兩組大鼠建模前后50%PWT值比較 （g，±s）

組別 建模前 建模后1周 建模后2周 建模后3周 建模后4周 建模后5周 建模后6周C組 9.87±1.22 10.83±1.54 10.67±1.53 10.44±1.32 10.22±1.31 9.04±1.92 9.48±1.39 D組 10.31±1.64 9.61±0.92 7.61±1.24 5.31±0.96 3.79±0.58 3.71±0.62 3.61±0.43 P值 0.384 0.171 0.006 0.000 0.000 0.000 0.000

兩組大鼠在建模后第6周處死，進(jìn)行脊髓背角免疫組織化學(xué)檢測(cè)。組內(nèi)比較發(fā)現(xiàn)CALHM1主要在脊髓背角處表達(dá)，而在脊髓其他部位表達(dá)較少；兩組間比較發(fā)現(xiàn)D組大鼠脊髓背角神經(jīng)元細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)中CALHM1的表達(dá)明顯多于C組，表現(xiàn)為CALHM1陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量明顯增多，染色較深。采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件對(duì)兩組所有圖片進(jìn)行積分光密度（integral optical density，IOD）定量分析，發(fā)現(xiàn)兩組脊髓背角神經(jīng)元細(xì)胞CALHM1的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。免疫組織化學(xué)法檢測(cè)CALHM1在兩組大鼠脊髓背角中的表達(dá)，C組大鼠脊髓背角中僅有少數(shù)神經(jīng)元CALHM1的表達(dá)為陽(yáng)性（見(jiàn)圖1、2）；D組大鼠脊髓背角中CALHM1在大部分神經(jīng)元細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，并且呈強(qiáng)陽(yáng)性（見(jiàn)圖3、4）。見(jiàn)表5。

圖1 C組大鼠脊髓背角免疫組織化學(xué)染色 （×100）

圖2 C組大鼠脊髓背角免疫組織化學(xué)染色 （×400）

圖3 D組大鼠脊髓背角免疫組織化學(xué)染色 （×100）

圖4 D組大鼠脊髓背角免疫組織化學(xué)染色 （×400）

表5 兩組大鼠脊髓背角免疫組織化學(xué)檢測(cè)比較

2.5 兩組大鼠脊髓組織Western blot檢測(cè)

兩組大鼠脊髓組織CALHM1的表達(dá)采用Western blot檢測(cè)。比較發(fā)現(xiàn)D 組大鼠脊髓CALHM1表達(dá)明顯高于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。Western blot檢測(cè)兩組大鼠脊髓中CALHM1的表達(dá)，C組大鼠脊髓中CALHM1的表達(dá)低于D組。將兩組大鼠脊髓中CALHM1表達(dá)的Western blot檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行灰度掃描，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)D組大鼠脊髓中CALHM1表達(dá)明顯高于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)圖5、6。

圖5 兩組大鼠脊髓CALHM 1蛋白表達(dá)的比較

2.6 兩組大鼠脊髓組織CALHM 1 m RNA實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測(cè)

兩組大鼠脊髓組織CALHM1 mRNA采用qRTPCR檢測(cè)。比較發(fā)現(xiàn)D組大鼠脊髓CALHM1mRNA表達(dá)明顯高于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見(jiàn)圖7和表6。

圖6 兩組大鼠脊髓CALHM1表達(dá)的比較

圖7 兩組大鼠脊髓中CALHM 1 m RNA的表達(dá)

表6 兩組大鼠qRT-PCR Ct值及CALHM 1 m iRNA表達(dá)量分析表

2.7 大鼠脊髓CALHM 1 m RNA表達(dá)水平與50%縮足反應(yīng)閾值的相關(guān)性分析

圖8 大鼠脊髓CALHM1 mRNA表達(dá)水平與50%PWT相關(guān)性分析

為驗(yàn)證PDN敏感大鼠的CALHM1 mRNA表達(dá)水平是否與痛閾相關(guān)，本研究統(tǒng)計(jì)分析建模后6周D組大鼠脊髓CALHM1 mRNA表達(dá)水平與建模后第6周D組大鼠50%PWT的相關(guān)性。Pearson檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析顯示，建模后6周D組大鼠脊髓CALHM1 mRNA表達(dá)水平與50%PWT呈負(fù)相關(guān)，危險(xiǎn)系數(shù)為-0.859 4，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見(jiàn)圖8。

3 討論

2008年，MARAMBAUD的研究小組發(fā)現(xiàn)一個(gè)與阿爾茨海默病發(fā)病有關(guān)的新基因，即CALHM1基因，其表達(dá)產(chǎn)物CALHM1是一個(gè)多重跨膜糖蛋白[8]。CALHM1基因表達(dá)的糖基化蛋白主要表達(dá)于成人腦組織的神經(jīng)元或其他可興奮細(xì)胞的細(xì)胞膜或者內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，其他組織器官表達(dá)水平較低[9]。由于CALHM1在維持鈣穩(wěn)態(tài)和淀粉樣蛋白β 調(diào)節(jié)中具有重要功能，因此被視為可能在癲癇發(fā)作中具有重要功能的基因[10]。最新研究表明，CALHM1是電壓門控性、ATP親水性離子通道及甜、鮮、苦等Ⅱ型味覺(jué)細(xì)胞ATP釋放通道。CALHM1基因在所有味蕾Ⅱ型味覺(jué)細(xì)胞中表達(dá)[11]，其翻譯的蛋白與連接蛋白和通道蛋白的結(jié)構(gòu)及功能相似[6]。CALHM1基因敲除后大鼠失去甜、鮮、苦味覺(jué)，并且伴有味覺(jué)神經(jīng)反應(yīng)受損[12]。這一研究說(shuō)明CALHM1并不只在大腦中表達(dá)，在其他可興奮細(xì)胞中也發(fā)揮作用。

PDN是糖尿病患者常見(jiàn)的并發(fā)癥，好發(fā)于四肢，是糖尿病患者對(duì)疼痛刺激或輕微、正常非疼痛刺激的過(guò)激反應(yīng)。糖尿病患者的背根神經(jīng)節(jié)中疼痛感覺(jué)神經(jīng)元處于過(guò)度興奮狀態(tài)，導(dǎo)致PDN[13]。有研究顯示，Cav3.2 T型鈣及TRPV1通道參與PDN的發(fā)生[14]。氧化應(yīng)激通過(guò)靶向TRP通道也參與PDN[15]，但具體機(jī)制尚不清楚。

細(xì)胞外鈣離子濃度在維持生理功能方面發(fā)揮重要作用，生理或病理?xiàng)l件下改變鈣離子濃度可以調(diào)節(jié)神經(jīng)元興奮性。而CALHM1是構(gòu)成調(diào)節(jié)神經(jīng)元興奮性相關(guān)細(xì)胞外鈣離子濃度離子通道的一個(gè)重要亞基[7]。因此，本研究假設(shè)CALHM1參與PDN。

首先，本研究成功構(gòu)建PDN大鼠模型，并檢測(cè)兩組大鼠的行為學(xué)變化，確認(rèn)PDN模型構(gòu)建成功，然后采用免疫組織化學(xué)法定位檢測(cè)大鼠脊髓背角CALHM1的表達(dá)。結(jié)果顯示，大鼠脊髓背角CALHM1表達(dá)陽(yáng)性的神經(jīng)元顯著多于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，除脊髓背角外，脊髓其他部分的CALHM1表達(dá)不明顯。因此，在利用Western blot定量檢測(cè)CALHM1蛋白質(zhì)表達(dá)以及利用qRT-PCR定量檢測(cè)CALHM1 mRNA表達(dá)時(shí)，并未再檢測(cè)脊髓背角，而是采用更簡(jiǎn)便的方式直接檢測(cè)整個(gè)脊髓腰膨大部分的CALHM1表達(dá)。Western blot結(jié)果顯示，PDN大鼠脊髓腰膨大部分的CALHM1表達(dá)顯著高于對(duì)照組；qRT-PCR結(jié)果顯示，CALHM1大鼠脊髓腰膨大部分CALHM1mRNA表達(dá)顯著高于對(duì)照組。這說(shuō)明PDN大鼠脊髓CALHM1表達(dá)顯著高于對(duì)照組。為進(jìn)一步證實(shí)PDN大鼠脊髓背角CALHM1的表達(dá)上調(diào)與PDN大鼠行為學(xué)改變的關(guān)系，從而驗(yàn)證CALHM1在脊髓的表達(dá)變化是否參與大鼠脊髓痛閾改變，本研究統(tǒng)計(jì)分析PDN大鼠建模6周后，脊髓腰膨大部分CALHM1 mRNA表達(dá)水平與50%PWT的相關(guān)性。結(jié)果顯示，兩者呈負(fù)相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明PDN大鼠脊髓背角CALHM1表達(dá)越高，50%PWT越低。因此，筆者認(rèn)為CALHM1的高表達(dá)與PDN相關(guān)，但其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，PDN大鼠脊髓背角神經(jīng)元上CALHM1表達(dá)較正常對(duì)照組顯著增高；CALHM1與PDN發(fā)生相關(guān)，為CALHM1作為潛在治療PDN的生物學(xué)靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)和理論依據(jù)。

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