人腦膠質瘤中microRNA-221的表達及臨床意義*

李新星，于奇，田羽，張健，刁宏宇，劉云會

（中國醫科大學附屬盛京醫院 神經外科，遼寧 沈陽110004）

膠質瘤起源于神經膠質細胞，是最常見的原發性顱內腫瘤，約占成人顱內腫瘤的35%～61%，其中超過60%的膠質瘤呈現惡性表達。盡管采用先進的手術、化療、放療等綜合治療手段，療效仍不理想。因此研究膠質瘤的發生、發展機制，尋找新的基因治療手段已迫在眉睫。目前，從分子生物學方面抑制膠質瘤的惡性進展已成為新的可行方法。Micro RNAs（miRNAs）是長度為21～25核苷酸的短序列、非編碼、具有調控功能的單鏈小分子RNA，microRNA-221（miR-221）轉錄后通過促進靶mRNA的降解和/或抑制翻譯而發揮負調控基因表達作用[1]。近年來有研究表明，miR-221在黑色素瘤[2]、乳腺癌[3]以及前列腺癌等[4]多種腫瘤中出現過表達，并且與腫瘤的發生密切相關。本研究旨在探討miR-221在膠質瘤中表達和預后價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2011年1月1日-2014年7月31日在中國醫科大學附屬盛京醫院神經外科診斷為膠質瘤患者45例，男性30例，女性15例。所有患者經病理檢查證實。收集并分析所有患者的腫瘤組織及瘤組織旁正常組織樣本，其中低級別膠質瘤13例，高級別膠質瘤32例。既往有免疫系統疾病及其他系統癌癥病史患者均被排除。所有參與患者在研究前都知情同意，研究方案由中國醫科大學盛京醫院倫理委員會批準。

1.2 試劑與方法

總RNA按照miRNeasy小型試劑盒（加拿大Qiagen公司）說明書從樣本中提取，通過Nano DropTM1000分光光度計（美國Nano Drop公司）提取RNA在260/280（RNA/DNA）和260/230（RNA/Protein）處的吸光度以確定其濃度。所有的樣本置入-80℃冰箱冷凍保存。用TaqManRMicro RNA逆轉錄試劑盒（美國Applied Biosystems公司生產）進行逆轉錄反應。5μl混合體系包含0.5μl不同引物，0.05μl的100 mmol dTNPs，0.5μl的10×逆轉錄緩沖液，0.063μl的20 u/μl RNA酶抑制劑，0.330μl的50 u/μl Multiscribe逆轉錄酶、RNA樣品以及去RNA酶水用于cDNA合成。根據RNA的濃度來確定其體積并使得最終反應的體積歸一化。

定量PCR的反應體系包含2μl cDNA、5μl TaqManR2×Perfect Master Mix、0.25μl針對不同miRNA的特異引物以及2.75μl去RNA酶水，使總體積為10μl。在Bio-Rad IQ5（美國Bio-Rad Laboratories公司）熱循環儀中進行PCR反應。以U6 snRNA（美國Ambion公司）作為內參，反應體系中包含U6的特異性引物。PCR擴增的步驟如下：95℃預變性3min，95℃變性15 s，60℃退火30 s，共40個循環，置于4℃冰箱保存。根據Bio-Rad iQ5 2.1標準版光學系統軟件讀取的循環閾值（threshold cycle，Ct）來確定miRNA的表達程度。

1.3 統計學方法

采用Stata 12.0統計軟件進行數據分析，用t檢驗來評估miR-221在膠質瘤組織和瘤組織旁正常對照組中的表達差異；建立受試者工作特征（receiveroperating characteristic，ROC）曲線，計算ROC曲線下面積（area under the curves，AUC）來評估miR-221在膠質瘤組織和瘤組織旁正常組織中表達水平的差異；約登指數篩選最佳臨界值；采用Logistic回歸分析評估標記物與膠質瘤的相關性；依據隨訪數據利用Kaplan-Meier法對膠質瘤患者進行生存分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

收集并分析所有患者的膠質瘤組織及瘤組織旁正常組織樣本。miR-221在膠質瘤組織中的表達顯著升高（P=0.000）（見圖1）；進一步通過ROC分析和AUC值驗證miR-221在膠質瘤組織的表達水平顯著高于正常組織。ROC曲線顯示，miR-221區分腫瘤組織的表達水平有效值（AUC=0.74，95%CI：0.63和0.84）（見圖2）。miR-221的最佳臨界值為2.17，敏感性為0.73，特異性為0.69。

圖1 m iR-221在膠質瘤組織和瘤旁非腫瘤組織中的表達水平比較

圖2 m iR-221在膠質瘤組織和瘤組織旁非腫瘤組織中的ROC曲線分析

為進一步研究miR-221的表達與膠質瘤的發展和患者臨床特征的關系，所有參與的患者根據性別、年齡、腫瘤大小和分化程度進行分類。通過t檢驗和單因素方差分析評估miR-221在不同組中的表達。結果表明，miR-221的表達與患者的性別及年齡無明顯相關。隨著膠質瘤病理級別的升高，miR-221表達水平出現顯著上調（P=0.049）；然而miR-221的表達與腫瘤大小無明顯相關（P=0.060）。見附表。

對45例患者進行術后隨訪，直至死亡或至2014年7月31日。依據隨訪數據利用Kaplan-Meier法對膠質瘤患者進行生存分析，確定miR-221的預后價值。根據miR-221表達程度對樣本分組，并用Logrank檢驗分析統計學意義。高表達是指miR-221表達水平高于平均水平，反之亦然。miR-221高表達的患者具有較差的預后（HR=2.18，95%CI：1.02和4.65，P=0.044）。見圖3。

附表 不同臨床特征患者的m iR-221表達比較 （±s）

附表 不同臨床特征患者的m iR-221表達比較 （±s）

注：1）t檢驗；2）單因素方差分析

臨床特征 例數 miR-221的表達 P值性別女15 3.25±0.76 0.4121）男30 3.56±1.34年齡/歲<50 18 3.76±1.12 0.2791）≥50 27 3.34±1.34直徑/cm≥5 14 3.95±1.45 0.0602）3～5 12 3.35±1.12<3 19 2.97±0.85分化低級別 13 3.84±0.56 0.0491）高級別 32 3.32±0.85

圖3 m iR-125b高低表達組膠質瘤患者的K-W 曲線

3 討論

膠質瘤是中樞神經系統最常見的惡性腫瘤，發病率高，預后差。膠質瘤的5年生存率<3%，僅次于胰腺癌和肺癌。因此，研究膠質瘤診斷和預后的新型生物標記物具有極其重要的意義。miRNA定位于腫瘤中會發生改變的染色體區域，miRNA的遺傳變異、擴增、缺失或基因沉默都可能引起特定的腫瘤發生或者提高個體的腫瘤易感性[5]。因而，檢測腫瘤組織中特定miRNA的表達對于腫瘤的早期診斷、病理分型分級、預后判斷等具有重大意義。本研究發現miR-221在膠質瘤組織中表達上調，而且隨著腫瘤病理級別的升高，miR-221表達水平出現顯著上調。

miRNA證實與癌變過程的多個方面相關。miRNA通過靶向某些基因，不僅參與細胞周期進程及增殖的調控，也能參與腫瘤侵襲和轉移的調控。研究還發現miRNA在腫瘤抗化療和放療的機制中起重要作用。MEDINA等[6]研究發現上調miR-221會干擾生長因子信號途徑，刺激細胞增殖。p27kip1是一種調控細胞周期、抑制細胞分裂的重要基因，其異常表達將影響細胞周期進程，進而影響細胞增殖，與腫瘤發生、發展密切相關。ZHANG等[7]發現，miR-221是抑癌基因p27Kip1的調控因子，能在體內及體外減弱p27 Kip1的表達，從而促進膠質瘤細胞增殖。這些數據都證明miR-221在細胞周期、細胞增殖及侵襲的調控中具有重要作用。miR-221的過表達會激活Akt途徑，增強膠質瘤的惡性表型[8]。miR-221也能抑制細胞凋亡，PUMA是2001年報道的Bcl-2家族新成員，因其可被p53快速誘導并具有強大的促凋亡作用而得名。miR-221能靶向抑制膠質瘤細胞促凋亡基因PUMA的表達[9]。在膠質瘤的發生過程中，過表達miR-221會誘導酪氨酸蛋白激酶μ（PTPμ）的表達下調，PTPμ 能調節細胞遷移參與癌變過程[10]。miR-221靶向相關基因，通過PTEN和PI3-K/Akt通路調節上皮間質轉化，其對Connexin43的調節也被認為與膠質瘤有關[11-12]。此外，miR-221的過表達可能使膠質瘤細胞對化療和放療的敏感性產生影響，下調miR-221的表達可以提高膠質瘤細胞對替莫唑胺的敏感性[13]。O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶（MGMT）能夠修補替莫唑胺化療引起的DNA損傷，而下調miR-221的表達能減少MGMT的表達，令細胞無法修復DNA損傷，并促進替莫唑胺介導的細胞死亡[14]。研究表明，miR-221在放療過程中亦起重要作用，miR-221能在膠質瘤細胞中激活，而且不依賴PTEN的Akt途徑，下調miR-221的表達后可顯著提高膠質瘤細胞的放射敏感性[15]。本研究結果表明，膠質瘤患者的預后與miR-221表達水平顯著相關，預后效果較差的患者具有更高的miR-221表達水平，這可能與膠質瘤細胞對放療和化療的敏感程度有關。miR-221高表達的患者對治療的敏感性較低，可能造成較差的預后效果。

目前，已發現許多與膠質瘤相關的miRNA，但能反映膠質瘤生物學特征的特異性miRNA表達譜仍不明確。本研究表明，miR-221在膠質瘤組織中的表達顯著高于正常組織，而且與膠質瘤的病理級別呈正相關。隨著對miRNA-221的進一步研究，有利于更加深入了解miRNA-221在膠質瘤病程中的作用，推動miRNA-221成為膠質瘤診斷、病理分型、預后判斷的新的分子生物學標記物，進一步使其成為可能的藥物靶點，從而實現miRNA-221對膠質瘤的診斷和個性化治療。

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