升紅顆粒的提取純化工藝研究

何 潔 陳大建 李 江* 甘潔靜 林家怡 袁萍萍 陳民鳳

1.桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥學(xué)部，廣西 桂林 541001；2.解放軍75750部隊(duì)，廣西 柳州 545606

升紅顆粒的提取純化工藝研究

何 潔1陳大建2李 江1*甘潔靜1林家怡1袁萍萍1陳民鳳1

1.桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥學(xué)部，廣西 桂林 541001；2.解放軍75750部隊(duì)，廣西 柳州 545606

目的：優(yōu)選升紅顆粒提取純化工藝的最佳條件。方法：處方中的雞血藤和花生紅衣用水提取，提取液濃縮后醇沉純化。設(shè)計正交試驗(yàn)方法，以兒茶素、總黃酮含量為評價指標(biāo)，對水提取工藝條件進(jìn)行考察；以兒茶素、總黃酮轉(zhuǎn)移率和浸膏得率為指標(biāo)對醇沉純化工藝條件進(jìn)行考察。結(jié)果：水提取的最佳工藝條件為加水量為藥材量的12倍，每次提取時間為1.5h，共提取3次；醇沉純化的最佳工藝條件為濃縮液相對密度為1.10～1.15g/ml(30℃)，含醇量為70%，靜置時間36h。 結(jié)論：優(yōu)選出的最佳工藝條件經(jīng)驗(yàn)證其結(jié)果穩(wěn)定，指標(biāo)性成分含量高，可以用于投入生產(chǎn)。

升紅顆粒；正交試驗(yàn)設(shè)計；兒茶素；總黃酮

升紅顆粒是根據(jù)我院腫瘤科臨床驗(yàn)方開發(fā)的純中藥復(fù)方制劑，由雞血藤、花生紅衣、大棗、枸杞子等藥材組成，用于治療腫瘤患者化療誘導(dǎo)的血小板減少癥。研究證實(shí)，雞血藤和花生紅衣均含有具有刺激造血祖細(xì)胞增殖作用的兒茶素類成分[1-2]，而雞血藤中的黃酮類成分也具有促進(jìn)血虛動物模型造血功能的作用[3]。因此，在研究制劑工藝時以兒茶素含量和總黃酮含量作為考察提取純工藝的指標(biāo)。考慮到原方以水煎入藥，且兒茶素和黃酮類成分在水、醇中的溶解性均較好，因此采用了傳統(tǒng)的水提醇沉工藝路線，設(shè)計正交試驗(yàn)方法，對水煎煮提取和醇沉純化兩步驟的影響因素進(jìn)行考察，對工藝條件進(jìn)行優(yōu)選，為升紅顆粒制劑工藝的制定提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1100 Series 高效液相色譜儀；Libra S32 紫外分光光度計(英國 Biochrom)；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；SHZ-Ⅲ循環(huán)水真空泵(上海亞榮生化儀器廠)；FA2004電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 試藥 兒茶素對照品(批號：110877-201203，中國食品藥品檢定研究院)；蘆丁對照品(批號：100080-200707，中國食品藥品檢定研究院)；甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑為分析純；雞血藤(批號：140201，安徽井泉集團(tuán)中藥飲片有限公司)；花生紅衣(批號：20130112，豪州成源中藥飲片有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 高效液相色譜法測定兒茶素的含量[4]

2.1.1 色譜條件 色譜柱為Agilent HC-C18(4.6×250mm，5μm)；流動相為水-甲醇-乙腈-冰醋酸(90∶5∶5∶0.4)；檢測波長280nm；流速0.8ml/min；柱溫35℃。此條件下兒茶素色譜峰的保留時間為20.03min，理論塔板數(shù)為4169，分離度為19.03，拖尾因子為0.99。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱定兒茶素對照品約10.0mg，置10ml容量瓶中，甲醇定容，配制成含量為0.98172mg/ml的對照品溶液。精密量取對照品溶液0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0ml分別置于10ml容量瓶中，甲醇定容，20μl進(jìn)樣測定，以進(jìn)樣量(X，μg)對色譜峰面積(Y)進(jìn)行線性回歸，回歸方程為：Y=666049X-23116，相關(guān)系數(shù)r=0.9999，線性范圍為0.098172～3.92688μg。

2.1.3 樣品中兒茶素的含量測定 按正交試驗(yàn)設(shè)計各次實(shí)驗(yàn)規(guī)定的條件制備樣品，精密量取規(guī)定體積的樣品液，置蒸發(fā)皿中水浴蒸干，用流動相溶解，過濾后定容于25ml容量瓶，過0.45μm微孔濾膜后進(jìn)樣20μl測定峰面積，代入回歸方程計算兒茶素的進(jìn)樣量，換算成雞血藤和花生紅衣藥材總量中兒茶素的含量。

2.2 絡(luò)合-分光光度法測定總黃酮含量[5-6]

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱定蘆丁對照品約10mg，用50%的乙醇定容于50ml容量瓶，制成對照品溶液(0.1830mg/ml)。精密量取對照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml分別置于25ml容量瓶中，各加50%乙醇使成5ml，再各加5%亞硝酸鈉溶液1.0ml，搖勻，放置6min，各加10%硝酸鋁溶液2.0ml，搖勻，放置6min；再各加4.3%氫氧化鈉試液10ml，分別用50%乙醇稀釋至刻度，搖勻，放置15min，制成待測對照品溶液。以第一瓶為空白對照，在510nm處測定各濃度對照品溶液吸光度，以吸光度(A)對濃度(C，mg/ml)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程C=0.0811A-0.0012(r=0.9995)，線性范圍為0.0183-0.0915mg/ml。

2.2.2 樣品中總黃酮的含量測定 按正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計各次實(shí)驗(yàn)規(guī)定的條件制備樣品，精密吸取規(guī)定體積的樣品液，置蒸發(fā)皿中水浴蒸干，用50%的乙醇溶解，過濾定容于100ml容量瓶中，精密量取0.0、1.0ml，分別置25ml容量瓶中，按照“2.2.1項(xiàng)”下的方法操作，過濾，取續(xù)濾液在510nm處測定吸光度，代入回歸方程計算總黃酮的含量，換算成雞血藤和花生紅衣藥材總量中總黃酮的含量。

2.3 浸膏得率的測定 精密量取25ml樣品溶液，置于已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，105℃干燥至恒重，置于干燥器中冷卻30min，迅速稱重，換算成雞血藤和花生紅衣藥材總量中浸膏得率。

2.4 工藝條件篩選的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計

2.4.1 水煎煮提取工藝 以加水量(A，以藥材量的倍數(shù)計算)、煎煮時間(B，以沸騰時開始計時)、煎煮次數(shù)(C)作為試驗(yàn)因素，每個因素備選了3個水平，詳見表 1。

利用L9(34)正交表安排實(shí)驗(yàn)，按2倍處方量稱取雞血藤、花生紅衣藥材粗粉適量，按各次實(shí)驗(yàn)因素水平的要求進(jìn)行水煎煮提取，過濾后合并，定容于1000ml容量瓶，精密量取樣品液20ml，置蒸發(fā)皿中水浴蒸干，按照“2.1.3”和“2.2.2”項(xiàng)下方法測定兒茶素和總黃酮含量。

2.4.2 醇沉工藝 水煎煮提取液中含有糖類、氨基酸、鞣質(zhì)等水溶性雜質(zhì)，造成收膏率高，影響后續(xù)的制劑成型和日服量，故考慮醇沉除雜。以濃縮液相對密度(D)、含醇量(E)、靜置時間(F)作為實(shí)驗(yàn)因素，每個因素備選3個水平，條件見表2。

表1 水煎煮提取正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

表2 醇沉正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

利用L9(34)正交表安排實(shí)驗(yàn)，按6倍處方量稱取雞血藤、花生紅衣藥材粗粉適量，以最佳水煎煮提取工藝提取后，過濾，合并濾液，濃縮成規(guī)定相對密度(30℃)的稠膏，精密稱定重量。然后將稠膏分成四份，精密稱定重量，其中一份用水稀釋定容于100ml容量瓶，用于測定該次最佳水煎煮提取實(shí)驗(yàn)兒茶素和總黃酮的含量；另外三份精密測定體積，然后加乙醇至規(guī)定的含醇量，靜置規(guī)定的時間，過濾，定容于100ml容量瓶，用于測定醇沉后的兒茶素、總黃酮含量和浸膏得率。兒茶素和總黃酮含量的測定:精密量取樣品液5ml，置蒸發(fā)皿中水浴蒸干，按照“2.1.3”和“2.2.2”項(xiàng)下方法測定。根據(jù)醇沉前后兒茶素、總黃酮含量的變化，計算醇沉后兒茶素、總黃酮的轉(zhuǎn)移率。

醇沉后兒茶素轉(zhuǎn)移率=醇沉后兒茶素的含量/該次水煎煮提取實(shí)驗(yàn)兒茶素含量×100%

醇沉后總黃酮轉(zhuǎn)移率=醇沉后總黃酮的含量/該次水煎煮提取實(shí)驗(yàn)總黃酮含量×100%

2.5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

2.5.1 水煎煮提取各次正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及方差分析 見表3、表4。

表3 水煎煮提取正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計表及結(jié)果

注：綜合評分*=(兒茶素含量/兒茶素含量最大值)×60% +(總黃酮含量/總黃酮含量最大值)×40%

表4 水煎煮提取正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析

F0.05(2，2)=19.00，F(xiàn)0.01(2，2)=99.00

由表3可知，水煎煮提取實(shí)驗(yàn)各因素對兒茶素提取率的影響大小為C>B>A，最佳工藝條件為A1B3C3；對總黃酮提取率的影響大小為C>A>B，最佳工藝條件為A3B1C3。表4方差分析的結(jié)果表明，A、B兩個因素對兒茶素、總黃酮提取率的影響無統(tǒng)計學(xué)意義，而C因素對兒茶素、總黃酮提取率的影響有統(tǒng)計學(xué)意義。由于水煎煮提取的目標(biāo)主要是具有刺激造血祖細(xì)胞增殖作用的兒茶素，故以兒茶素含量權(quán)重為60%，總黃酮含量權(quán)重為40%進(jìn)行加權(quán)綜合評分，由綜合評分的極差分析可知，各因素對綜合評分的影響大小為C>B>A，最佳工藝條件為A3B3C3；方差分析表明A、B兩因素對綜合評分的影響無統(tǒng)計學(xué)意義，而C因素對綜合評分的影響有統(tǒng)計學(xué)意義。因此選擇水煎煮提取的最佳工藝條件為A3B3C3，即加水量為12倍，煎煮時間為1.5h，煎煮次數(shù)為3次。

按照最佳水煎煮提取工藝條件進(jìn)行3次驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，兒茶素平均含量為1.0204mg/g，總黃酮平均含量為77.9289mg/g，證明該工藝條件是穩(wěn)定、可行的。

2.5.2 醇沉各次正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及方差分析 見表5、表6。

表5 醇沉正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計表及結(jié)果Tab.5 The results of ethanol precipitating orthogonal experiment

注：綜合評分*=(兒茶素轉(zhuǎn)移率/兒茶素轉(zhuǎn)移率最大值)×50% +(總黃酮轉(zhuǎn)移率/總黃酮轉(zhuǎn)移率最大值)×30% +(浸膏得率最大值/浸膏得率)×20%

表6 醇沉正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析

F0.05(2，2)=19.00，F(xiàn)0.01(2，2)=99.00

由表5可知，醇沉實(shí)驗(yàn)各因素對兒茶素轉(zhuǎn)移率的影響大小為A>B>C，最佳工藝條件為A2B3C2；對總黃酮轉(zhuǎn)移率的影響大小為B>C>A，最佳工藝條件為A2B3C3；對浸膏得率的影響大小為A>C>B，最佳工藝條件為A3B1C1。表6方差分析的結(jié)果表明，A、B、C三個因素對兒茶素的轉(zhuǎn)移率的影響有統(tǒng)計學(xué)意義，而對總黃酮轉(zhuǎn)移率、浸膏得率的影響沒有統(tǒng)計學(xué)意義。由于醇沉的目標(biāo)主要是在保留兒茶素、黃酮等有效成分的基礎(chǔ)上除雜，故以兒茶素轉(zhuǎn)移率權(quán)重為50%，總黃酮轉(zhuǎn)移率權(quán)重為30%，浸膏得率權(quán)重為20%進(jìn)行加權(quán)綜合評分(由于浸膏得率與醇沉純化效果成反比關(guān)系，故以浸膏得率倒數(shù)進(jìn)行評分)，由綜合評分的極差分析可知，各因素對綜合評分的影響大小為B>A>C，最佳工藝條件為A2B3C3；方差分析表明A、B、C三個因素對綜合評分的影響均有統(tǒng)計學(xué)意義。因此選擇醇沉的最佳工藝條件為A2B3C3，即濃縮液相對密度為1.10～1.15g/ml，含醇量為70%，靜置時間為36h。按照最佳醇沉工藝條件進(jìn)行3次驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，兒茶素轉(zhuǎn)移率平均為78.54%，總黃酮轉(zhuǎn)移率平均為87.89%，浸膏得率平均為0.1471g/g，證明該工藝條件是穩(wěn)定、可行的。

3 討論

進(jìn)行醇沉工藝研究時，將最佳水煎煮提取后的樣品濃縮到規(guī)定的相對密度后進(jìn)行醇沉，因此醇沉后的兒茶素、總黃酮的含量與醇沉前樣品中的兒茶素、總黃酮含量直接相關(guān)。由于各次最佳水煎煮提取的樣品中兒茶素、總黃酮的含量并不相同，最佳水煎煮提取的樣品中兒茶素、總黃酮的含量偏高者，醇沉后兒茶素、總黃酮含量也會相應(yīng)偏高，如果直接以醇沉后兒茶素、總黃酮的含量作為醇沉工藝條件的考查指標(biāo)，可能帶來較大的誤差。因此，對最佳水煎煮提取的樣品抽樣測定其兒茶素、總黃酮的含量，再對醇沉后的樣品測定兒茶素、總黃酮含量，根據(jù)醇沉前后兒茶素、總黃酮含量的變化，計算醇沉后兒茶素、總黃酮的轉(zhuǎn)移率，作為考查醇沉工藝條件的指標(biāo)，可以避免各次最佳水煎煮提取樣品中兒茶素、總黃酮的含量不一致而帶來的誤差。

采用絡(luò)合-分光光度法測定各次正交實(shí)驗(yàn)樣品中總黃酮含量，其實(shí)驗(yàn)原理是黃酮類物質(zhì)在堿性與亞硝酸根存在的環(huán)境下與鋁離子形成穩(wěn)定的紅色絡(luò)合物，但我們在制備供試品過程中發(fā)現(xiàn)有紅色沉淀產(chǎn)生，造成測定結(jié)果不穩(wěn)定。該現(xiàn)象與樣品中原花色素類物質(zhì)在堿性條件下形成沉淀，并與鋁離子形成絡(luò)合物有關(guān)[7]，因此根據(jù)文獻(xiàn)采取了增加硝酸鋁試液劑量，并過濾除去沉淀的辦法，較好地解決了該問題。

[1]劉屏，王東曉，陳桂蕓，等．雞血藤單體化合物對造血祖細(xì)胞增殖的調(diào)控作用研究[J].中國藥理學(xué)通報，2007，23(6)：741-745．

[2]梁寧，韋松基，林啟云．雞血藤總黃酮對血虛小鼠抗貧血作用及機(jī)理研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2009，20(2)：362-363．

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[7]曾凡駿，陳松波，曾里，等．一種改進(jìn)的銀杏黃酮紫外分光光度檢測方法的研究[J].食品科學(xué)， 2003，24(11)：102-104．

Study on Extraction and Purification Technique of Shenghong Granules

HE jie1，CHEN Da-jian2，LI jiang1*，GAN Jie-jing1，LIN Jia-yi1，YUAN Ping-ping1，CHEN Min-feng1

1.Department of Pharmacy, The Affiliated Hospital of Guilin Medical university，Guilin 541001，China；2.People's liberation army no. 75750，Liuzhou 545606，China

Objectice To optimize the conditions of the extraction and purification technique for Shenghong granules. Methods HerbCaulisSpatholobiand peanut coat in formulation were extracted by water decocting，and the condensed extracted liquid was purified by ethanol precipitating. Taking the content of catechin and total flavonoids as evaluation markers for the extraction technique of water decocting，and the transferring rate of the catechin and total flavonoids，and extract yield as evaluation markers for the purification technique of ethanol precipitating，each technique condition was evaluated by orthogonal design. Results The optimum condition of water decocting process was that the crude herb powder were decocted for 3 times with 12-fold water，1.5 hour each time. The optimum condition of ethanol precipitating process was that extracted liquid was precipitated 36 hours,which relative density was 1.10～1.15g/ml(30℃)and concentration of ethanol was 70% . Conlusions The repeated experimental results are stable on the optimum conditions, and the contents of components for markers are high. which could be used for enlarged production.

Shenghong granule; orthogonal design; catechin; total flavonoids

廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳中醫(yī)藥科技專項(xiàng)(編號：GZYZ1224)。

何潔(1982-)，女，廣東汕頭人，主管中藥師，主要從事中藥制劑和醫(yī)院藥學(xué)工作。

李江(1970-)，男，四川金堂人，主任藥師，主要從事中藥新藥研究開發(fā)和醫(yī)院藥學(xué)工作。

R284.2

A

1007-8517(2015)07-0021-05

2015.01.12)