新型苯并咪唑衍生物的合成及其抗凝血活性*

蔡志強，侯 旭，張 波，劉若燦

(沈陽工業大學石油化工學院，遼寧遼陽 111003)

達比加群酯是一種新型的凝血酶抑制劑，用于口服的前體藥物，屬非肽類凝血酶抑制劑。其母核中苯并咪唑所連的芳環取代的脒基造成了藥物的溶解性差和口服生物利用度低等缺點［1－4］，限制了其藥效的充分發揮。為獲得活性更強，溶解性和生物利用度更佳的苯并咪唑類藥物，本文整合了雷扎沙班及其類似物的設計理念，采用苯甲脒基環合形成苯并異惡唑，并將其另外一端側鏈用氨基酸取代的方法優化其結構，增大化合物透膜吸收從而改善其藥物代謝，并考察其構效關系。

Scheme 1

在文獻［5－10］方法的基礎上，本文以 3-［(3-氨基-4-甲基氨基苯甲酰)吡啶-2-基氨基］丙酸乙酯(1)為原料，與4-氰基-3-氟苯取代基乙酸(2a，2e)經環化反應制得 3-【【2-{［(4-氰基-3-氟苯取代基)甲基］-1-甲基-1H-苯并咪唑-5-基}羰基】吡啶-2-基】氨基丙酸乙酯(3a和3e);3a和3e分別經水解和酰胺化反應制得 3-【【【2-{［(4-氰基-3-氟苯基)取代基］甲基}-1-甲基-1H-苯并咪唑-5-基】羰基】吡啶-2-基氨基】丙酰取代胺基(6a～6h);6與乙酰氧肟酸經環合反應合成了8個新型的苯并咪唑衍生物7a～7h(Scheme 1)，其結構經1H NMR和HR-ESI-MS表征。并測定了7a～7h的抗凝血活性。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Bruker ARX-400 MHz型核磁共振儀(DMSO-d6為溶劑，TMS為內標);Agient1100型四級桿液質聯用儀;Bruker micro-TOF型高分辨質譜儀。

1按文獻［5］方法制備;其余所用試劑均為分析純。

1.2 合成

(1)3a和3e的合成(以3a為例)

在反應瓶中依次加入2-［(4-氰基-3-氟苯基)氨基］乙酸(2a)1.94 g(10 mmol)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDCI)1.9 g，1-羥基苯并三唑(HOBt)1.35 g，THF 35 mL和DMF 5 mL，冰水浴冷卻，攪拌反應30 min。升至室溫，緩慢滴加1 3.1 g(9 mmol)的 THF(15 mL)溶液，滴畢，反應6 h。除溶，加入二氯甲烷30 mL，用飽和鹽水(3×15 mL)洗滌，無水硫酸鎂干燥。過濾，濾液濃縮至干;剩余物中加入冰乙酸45 mL，回流反應2 h。減壓濃縮至干，加入濃氨水15 mL，攪拌下于室溫反應30 min。除溶，加入二氯甲烷25 mL，用飽和食鹽水(3×15 mL)洗滌，無水硫酸鎂干燥。過濾，濾液濃縮后經柱色譜［洗脫劑:A=V(CH2Cl2)∶V(MeOH)=20 ∶1］純化得淡黃色固體3a 3.30 g，產率 72.8%;1H NMR δ:1.12(t，J=7.2 Hz，3H)，2.69(t，J=7.2 Hz，2H)，3.76(s，3H)，3.98(q，J=7.2 Hz，2H)，4.21(t，J=7.2 Hz，2H)，4.63(d，J=4.4 Hz，2H)，6.84 ～6.89(m，3H)，7.11 ～7.15(m，2H)，7.38 ～7.58(m，3H)，7.67(d，J=8.4 Hz，2H)，8.37(d，J=2.8 Hz，1H);ESI-MS m/z:501.3{［M+H］+}。

用類似方法合成土棕色固體3e。

(2)4a和4e的合成(以4a為例)

在反應瓶中加入3a 2.42 g(1.5 mmol)和乙醇30 mL，攪拌使其溶解;滴加氫氧化鈉0.32 g(8 mmol)溶液5 mL，滴畢，反應3 h。蒸除1/3體積溶劑，用稀鹽酸調至pH 6。過濾，濾餅干燥得白色固體 4a 1.82 g，產率 79.7%;1H NMR δ:2.69(t，J=7.2 Hz，2H)，3.76(s，3H)，3.98(q，J=7.2 Hz，2H)，4.63(d，J=4.4 Hz，2H)，6.84 ～6.89(m，3H)，7.11 ～ 7.15(m，2H)，7.38 ～7.58(m，3H)，7.67(d，J=8.4 Hz，2H)，8.37(d，J=2.8 Hz，1H)，11.96(br，1H);ESIMS m/z:473.2{［M+H］+}。

用類似方法合成白色固體4e。

(3)6a～6h的合成(以6a為例)

在反應瓶中加入4a 4.72 g(0.01 mol)，EDCI 1.9 g，HOBt 1.35 g，碳酸鉀 1.38 g 和 DMF 25 mL，攪拌使其溶解;于冰水浴中反應1 h;升至室溫，加入纈氨酸甲酯(5a)鹽酸鹽 1.68 g(10 mmol)，反應6 h。除溶，加入二氯甲烷20 mL，用飽和鹽水(3×10 mL)洗滌，無水硫酸鎂干燥。過濾，濾液濃縮后經柱色譜(洗脫劑:A=25∶1)純化得淡黃色固體 6a 3.60 g，產率61.5%;1H NMR δ:0.88(d，J=6.8 Hz，6H)，2.32(m，1H)，2.69(t，J=7.2 Hz，2H)，3.70(s，3H)，3.74(s，3H)，3.98(q，J=7.2 Hz，2H)，4.25(d，J=7.2 Hz，1H)，4.63(d，J=4.4 Hz，2H)，6.84 ～6.89(m，3H)，7.11 ～ 7.15(m，2H)，7.38 ～7.58(m，3H)，7.67(d，J=8.4 Hz，2H)，8.37(d，J=2.8 Hz，1H);ESI-MS m/z:586.1{［M+H］+}。

用類似方法合成灰白色固體6b～6h。

(4)3-【2-{［(3-氨基苯基異惡唑-6-基)取代基］甲基}-1-甲基-N-(吡啶-2-基)-1H-苯并咪唑-5-羰基】丙酰取代基(7a～7h)的合成(以7a為例)

在反應瓶中加入6a 5.85 g(10 mmol)，碳酸鉀6.50 g，DMF 100 mL 和水 30 mL，攪拌使其溶解;分批加入乙酰氧肟酸2.04 g(30 mmol)，加畢，反應12 h。過濾，濾液濃縮至干后經柱色譜(洗脫劑:A=30∶1)純化得白色固體7a 4.20 g。

用類似方法合成白色固體7b～7h。

7a:產率 70.2%;1H NMR δ:0.83(d，J=6.8 Hz，6H)，2.32(m，1H)，2.64(t，J=7.2 Hz，2H)，3.71(s，3H)，3.78(s，3H)，3.94(q，J=7.2 Hz，2H)，4.22(d，J=7.2 Hz，1H)，4.58(d，J=4.4 Hz，2H)，6.81 ～6.88(m，3H)，7.10 ～ 7.19(m，2H)，7.33 ～ 7.55(m，3H)，7.64(d，J=8.4 Hz，2H)，8.39(d，J=2.8 Hz，1H)，8.56(br，2H);ESI-MS m/z:599.4{［M+H］+};HR-ESI-MS m/z:Calcd for C31H34N8O5{［M+H］+}599.660 2，found 599.661 7。

7b:產率 48.8%;1H NMR δ:2.62(t，J=7.2 Hz，2H)，3.69(s，3H)，3.78(s，3H)，3.94(q，J=7.2 Hz，2H)，4.19(d，J=7.2 Hz，2H)，4.58(d，J=4.4 Hz，2H)，6.81 ～6.88(m，3H)，7.10 ～ 7.19(m，2H)，7.33 ～ 7.55(m，3H)，7.64(d，J=8.4 Hz，2H)，8.39(d，J=2.8 Hz，1H)，8.56(br，2H);ESI-MS m/z:557.3{［M+H］+};HR-ESI-MS m/z:Calcd for C28H28N8O5{［M+H］+}557.580 5，found 557.582 7。

7c:產率 72.5%;1H NMR δ:0.85(d，J=6.8 Hz，3H)，2.62(t，J=7.2 Hz，2H)，3.70(s，3H)，3.77(s，3H)，3.92(q，J=7.2 Hz，2H)，4.21(d，J=7.2 Hz，1H)，4.54(d，J=4.4 Hz，2H)，6.81 ～6.88(m，3H)，7.14 ～7.19(m，2H)，7.33 ～7.52(m，3H)，7.60(d，J=8.4 Hz，2H)，8.37(d，J=2.8 Hz，1H)，8.53(br，2H);ESI-MS m/z:571.1{［M+H］+};HR-ESI-MS m/z:Calcd for C29H30N8O5{［M+H］+}571.241 7，found 571.240 2。

7d:產率 44.0%;1H NMR δ:0.91(d，J=6.8 Hz，6H)，1.56(m，1H)，1.99(m，2H)，2.64(t，J=7.2 Hz，2H)，3.71(s，3H)，3.78(s，3H)，3.94(q，J=7.2 Hz，2H)，4.42(d，J=7.2 Hz，1H)，4.58(d，J=4.4 Hz，2H)，6.81 ～6.88(m，3H)，7.10 ～ 7.19(m，2H)，7.33 ～7.55(m，3H)，7.61(d，J=8.4 Hz，2H)，8.22(d，J=2.8 Hz，1H)，8.46(br，2H);ESIMS m/z:613.4{［M+H］+};HR-ESI-MS m/z:Calcd for C32H36N8O5{［M+H］+}613.686 8，found 613.684 6。

7e:產率 65.2%;1H NMR δ:0.86(d，J=6.8 Hz，6H)，2.32(m，1H)，2.66(t，J=7.2 Hz，2H)，3.75(s，3H)，3.79(s，3H)，3.91(q，J=7.2 Hz，2H)，4.22(d，J=7.2 Hz，1H)，4.55(d，J=4.4 Hz，2H)，6.81 ～6.88(m，3H)，7.10 ～ 7.19(m，2H)，7.34 ～ 7.55(m，3H)，7.64(d，J=8.4 Hz，2H)，8.35(d，J=2.8 Hz，1H)，8.50(br，2H);ESI-MS m/z:600.3{［M+H］+};HR-ESI-MS m/z:Calcd for C31H33N7O6{［M+H］+}600.645 0，found 600.643 3。

7f:產率 36.9%;1H NMR δ:2.58(t，J=7.2 Hz，2H)，3.65(s，3H)，3.78(s，3H)，3.91(q，J=7.2 Hz，2H)，4.14(d，J=7.2 Hz，2H)，4.55(d，J=4.4 Hz，2H)，6.82 ～6.84(m，3H)，7.13 ～ 7.17(m，2H)，7.30 ～ 7.58(m，3H)，7.61(d，J=8.4 Hz，2H)，8.35(d，J=2.8 Hz，1H)，8.50(br，2H);ESI-MS m/z:558.2{［M+H］+};HR-ESI-MS m/z:Calcd for C28H27N7O6{［M+H］+}558.565 2，found 558.564 5。

7g:產率 46.7%;1H NMR δ:0.86(d，J=6.8 Hz，3H)，2.61(t，J=7.2 Hz，2H)，3.73(s，3H)，3.79(s，3H)，3.92(q，J=7.2 Hz，2H)，4.21(d，J=7.2Hz，1H)，4.54(d，J=4.4 Hz，2H)，6.81 ～6.88(m，3H)，7.14 ～7.19(m，2H)，7.33 ～7.52(m，3H)，7.62(d，J=8.4 Hz，2H)，8.31(d，J=2.8 Hz，1H)，8.53(br，2H);ESI-MS m/z:572.3{［M+H］+};HR-ESI-MS m/z:Calcd for C29H29N7O6{［M+H］+}572.591 8，found 572.590 9。

7h:產率26.8%;1H NMR δ:0.94(d，J=6.8 Hz，6H)，1.50(m，1H)，1.92(m，2H)，2.63(t，J=7.2 Hz，2H)，3.76(s，3H)，3.82(s，3H)，3.93(q，J=7.2 Hz，2H)，4.41(d，J=7.2 Hz，1H)，4.52(d，J=4.4 Hz，2H)，6.84 ～6.89(m，3H)，7.12 ～7.17(m，2H)，7.32 ～7.56(m，3H)，7.66(d，J=8.4 Hz，2H)，8.24(d，J=2.8 Hz，1H)，8.48(br，2H);ESI-MS m/z:614.2{［M+H］+};HR-ESI-MS m/z:Calcd for C32H35N7O6{［M+H］+}614.671 5，found 614.670 8。

1.3 抗凝活性評價-活化部分凝血活酶時間的測定

將質量18 g～20 g的昆明小鼠，隨機分組，每組10只，禁食過夜。將達比加群酯及7a～7h懸浮或溶解于1%的羧甲基纖維素鈉水溶液中，配成1 mg·mL－1的濃度，按 10 mg·Kg－1的劑量(折合成達比加群計算)灌胃給藥，30 min后通過心臟穿刺取血，加入4%枸杞酸鈉溶液至0.4%終濃度抗凝，12 000 r·min－1離心 5 min。取血漿0.1 mL，加入 aPTT 試劑 0.1 mL，于 37 ℃ 預溫 3 min，加入37℃氯化鈣溶液0.1 mL，用血小板聚集凝血因子分析儀測定凝固時間，即為aPTT值。

2 結果與討論

2.1 7 的合成

由于受到苯環對位雜原子的影響，7a～7d的產率明顯高于7e～7h。這可能由于其對位的LINKER雜原子氧的電負性大于氮的電負性，造成了環合時氰基鄰位的氟離去能力減弱，致使收率降低。其確切反應機理有待進一步研究。

2.2 抗凝血活性與結構的關系

7a～7h的抗凝血活性結果見表1。由表1可見，7d與達比加群酯的抗凝血活性基本相當;7h的活性比生理鹽水的更弱，可能是因為結構中所連的氧橋連與亮氨酸修飾后影響了其體內的吸收。7c和7g的aPTT值雖然較高，但在臨床上容易出現出血的風險;7a和7b既能延長凝血時間，又不至于出現出血的風險，因此活性較好;而7e和7f略比達比加群酯稍差，其原因可能在于與其相連的LINKER由氮替換為氧，使整個分子過于柔性，改變了其原有的空間大體骨架走向。在苯芳環與咪唑芳環所連接的LINKER需要采用略顯剛性的氮橋連，可增強7對抗凝血活性，若連接過于柔性的氧橋連，則致使抗凝血活性明顯降低，其構效關系有待進一步研究。

表1 7a～7h的抗凝活性Table 1 The inhibition activities of 7a～7h

3 結論

合成了8個新型的苯并咪唑類衍生物(7a～7h)。抗凝血活性實驗結果表明:7a和7b的抗凝血活性最好，其aPTT值分別為(83.1±4.2)s和(80.7 ±2.9)s，優于對照藥達比加群酯(75.3 ±2.1)s。

7a～7h的合成，對凝血抑制藥物的開發具有重要意義。

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