微生物發酵生產高品質番茄紅素的研究進展

王紅波，吳 華，陳禪友，劉 琴，潘 磊，郭 瑞，胡志輝

（江漢大學 生命科學學院 湖北省豆類（蔬菜）植物工程技術研究中心，湖北 武漢 430056）

番茄紅素（lycopene）是紅色的脂溶性色素，不溶于水，微溶于甲醇和乙醇，分子式為C40H56。番茄紅素主要由反式、9-順式、13-順式及15-順式四種異構體組成[1]，順式結構的番茄紅素生物利用度及抗氧化功能皆優于反式結構的番茄紅素[2]，且營養價值更高。番茄經加熱處理，其中的反式番茄紅素會順式異構生成順式番茄紅素，有利于提高番茄紅素的營養價值。番茄紅素多見于西紅柿，其抗氧化活性約為β-胡蘿卜素的2倍[3]。番茄紅素對人體健康的功效促進了番茄紅素在食品工業中的商業化發展。目前，食用番茄是人體獲取番茄紅素的主要方式。番茄紅素能減小機體細胞被活性氧自由基的氧化損傷，預防直腸癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、前列腺癌、膀胱癌、宮頸癌和皮膚癌，降低血液中膽固醇的含量，預防血清脂質過氧化和心腦血管疾病[4-10]。其他種類的類胡蘿卜素（包括β-胡蘿卜素）還未發現有顯著預防癌癥和心腦血管疾病的功能[11-12]。番茄紅素作為一種優良的抗氧劑，已被廣泛運用于食品、化妝品和醫藥領域，市場前景良好。

番茄紅素的分子結構式[13]：

用化學合成方法制備的番茄紅素由于副產物多，食品安全風險大，其市場前景局限性較大[14]。因此，天然的番茄紅素市場前景被看好，正成為食品添加劑、化妝品以及醫藥領域的研究熱點[15]。目前，天然番茄紅素的制備途徑主要有兩個：一是從番茄組織中提?。欢峭ㄟ^微生物發酵生物合成。番茄中番茄紅素含量低，約占番茄干物質的0.05%～0.10%[16]。番茄資源短缺以及番茄中番茄紅素含量不穩定都會嚴重影響從番茄中連續工業化提取番茄紅素的要求。用微生物發酵的方法生產番茄紅素，突破了番茄資源短缺和番茄紅素品質不穩定的限制，是最具工業化前景的制備天然番茄紅素的有效方法。番茄紅素的天然資源包括水果、蔬菜和微生物。微生物發酵的方法比從水果和蔬菜中提取的方法，在生產天然番茄紅素方面優勢突出[17]。

1 重組大腸桿菌發酵生產番茄紅素

用改造了代謝途徑的微生物生產有益的類胡蘿卜素是有希望取代植物細胞提取高效生產天然類胡蘿卜素的良好方法。HARADA H等[18]描述了用導入了外源甲羥戊酸途徑的大腸桿菌高效合成類胡蘿卜素的方法。發酵培養基中添加乙酰乙酸鋰，具有番茄紅素合成質粒的重組大腸桿菌中番茄紅素的含量能達到12.5 mg/g，番茄紅素的含量比不添加乙酰乙酸鋰的對照組增加了11.8倍?；蚬こ叹瓴环€定，需要持續的選擇壓力才能保持質粒的穩定。CHEN Y Y等[19]克服了這個不足，構建了不攜帶質粒和抗性標記的能合成番茄紅素的重組大腸桿菌。重組菌株通過三氯生誘導染色體進化獲得了基因高拷貝表達系統。即使發酵過程缺乏選擇試劑，工程菌株仍表現出良好的遺傳穩定性。用T5啟動子替換大腸桿菌固有的appY啟動子，并且敲除了iclR基因的大腸桿菌，其番茄紅素的合成能力進一步得到提高，番茄紅素的含量達到33.43 mg/g。ZHOU Y等[20]在敲除了6-磷酸葡萄糖脫氫酶基因zwf 的大腸桿菌中，進一步上調甲羥戊酸途徑限速酶基因idi（克隆異戊烯二磷酸異構酶）和dxs（克隆1-脫氧木酮糖-5-磷酸合成酶）的表達，增加了番茄紅素的含量，番茄紅素的含量達到了6.85～7.55 mg/g。SUN T等[21]敲除了生產β-胡蘿卜素大腸桿菌CAR001中的玉米黃素葡糖糖基轉移酶基因crtX和番茄紅素環化酶基因crtY；調控α酮戊二酸脫氫酶、琥珀酸脫氫酶和轉醛醇酶B的表達，增加還原型輔酶Ⅱ（triphosphopyridine nucleotide，NADPH）和腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）的供應；調控1-脫氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因dxs、異戊烯二磷酸異構酶基因idi和crt 基因操縱子的表達。分批發酵時，優化后的菌株LYC010，其番茄紅素的含量達到50.6 mg/g。ZHU F等[22]研究了定向改造甲羥戊酸途徑過量合成法尼烯，構建了番茄紅素生產重組大腸桿菌L3，在2.5 L發酵液分批發酵，產量達到1.44 g/L，當發酵規模擴大到100 L時，發酵32 h，番茄紅素的產量達到1.23 g/L，番茄紅素含量達到34.3 mg/g，番茄紅素最大的生產效率達到74.5 mg/（L·h），且重組菌株L3容易放大生產，有希望取代番茄紅素傳統的生產菌株三孢布拉霉工業化發酵生產番茄紅素。KIM Y S等[23]用葡萄糖和L-阿拉伯糖作為重組大腸桿菌生產番茄紅素的主要碳源甘油的輔助碳源，能有效促進菌體的生長和番茄紅素的生物合成，研究表明，在補料分批發酵過程中，添加10 g/L和7.5 g/L的葡萄糖和L-阿拉伯糖，生物量達到42 g/L，番茄紅素的含量達到了32 mg/g，分別比甘油作為單一碳源時提高了3.9和1.9倍。ZHANG T C等[24]研究表明，重組大腸桿菌在添加了6 g/L果糖的溶菌肉湯（lysogeny broth，LB）培養基上生長，能有效增加番茄紅素的產量，而葡萄糖作用很小，在250 mL三角瓶中，發酵24 h，番茄紅素的產量達到1 050 mg/L。

2 三孢布拉霉發酵生產番茄紅素

三孢布拉霉（Blakeslea trispora）菌體屬于接合菌門、接合菌綱、毛霉目、笄霉科、布拉霉屬[25]，其生長的過程表現為菌絲延長以及細胞核裂殖增多。在固體培養基上生長時，首先形成營養菌絲和氣生菌絲，最后生成菌苔，并萌發出孢子；在液體培養基中生長時，菌絲體會互相纏繞，最后形成菌絲球。三孢布拉霉菌體是異宗的接合菌，有正菌和負菌兩種單性菌株。正菌和負菌按照1∶1～1∶10的比例混合發酵生產類胡蘿卜素。三孢布拉霉菌體中類胡蘿卜素的成分少，幾乎僅能生成β-胡蘿卜素、γ-胡蘿卜素以及番茄紅素，是目前唯一能夠用來工業化發酵生產β-胡蘿卜素和番茄紅素的微生物[26-28]，其中以β-胡蘿卜素為主，通常能達到85%以上。

為了生產高純度的番茄紅素，三孢布拉霉菌體中的番茄紅素環化酶活性需完全抑制。因此番茄紅素環化酶抑制劑的抑制效果是用三孢布拉霉發酵生產高品質番茄紅素的關鍵。番茄紅素環化酶抑制劑主要有咪唑類化合物，吡啶類化合物物以及吖嗪類化合物[26]。根據已有的研究報道，常用的環化酶抑制劑有咪唑、吡啶、哌啶、煙酸、三乙胺和肌酐[29]。CHOUDHARI S M等[30]研究了用不同質量濃度（100 mg/L、500 mg/L、750 mg/L、1 000 mg/L）的咪唑、哌啶、三乙胺、吡啶、胡椒基丁醚、煙酸和肌酐用作環化酶抑制劑來生產番茄紅素。其研究結果表明，用500 mg/L的哌啶作為環化酶抑制劑，番茄紅素的純度能接近95%，抑制效果良好。PEGKLIDOU K等[31]用2-甲基咪唑作為環化酶抑制劑，菌體生長達到平衡期時，培養基中添加50 mg/L的2-甲基咪唑，番茄紅素的純度能達到94%。優良的番茄紅素環化酶抑制劑需具備以下幾個特征：用量少，抑制效果好，水溶性好，能降解。WANG H B等[32]用300 mg/L的2-異丙基咪唑，能完全抑制番茄紅素環化酶的活性，類胡蘿卜素中番茄紅素的含量能達到96%，2-異丙基咪唑為水溶性，易從番茄紅素中水洗分離，食品安全性高。2-異丙基咪唑可能會被活性污泥中假單胞菌降解，環境污染風險低。XU F等[33]在三孢布拉霉菌體發酵培養基中添加體積分數為1%的正己烷和正十二烷作為氧載體，番茄紅素產量分別提高了51%和78%，并且正十二烷和乳化劑司班-20一起使用效果更好。輔酶Q和麥角固醇的生物合成是番茄紅素合成途徑的兩個主要代謝支流[34]。輔酶Q和麥角固醇的合成會降低番茄紅素的合成能力，進而減小番茄紅素的產量，抑制輔酶Q和麥角固醇的生物合成能增加番茄紅素的產量。SUN Y等[35]分別用0.7 mg/L鹽酸特比萘芬和30 mg/L酮康唑分別作為麥角固醇生物合成的抑制劑，番茄紅素的產量分別增加了23%和277%。SHI Y等[36-37]研究了在三孢布拉霉菌體的發酵培養基中添加異戊烯基化合物和代謝前體來提高番茄紅素的產量，研究結果表明，發酵42 h后，發酵液中添加質量濃度為42 mg/L的香葉醇效果最佳，番茄紅素的產量達到578 mg/L，比未添加香葉醇的對照組提高了62%。

3 結論與展望

用重組大腸桿菌發酵生產番茄紅素。由于重組大腸桿菌中導入了外源的甲羥戊酸途徑和番茄紅素合成酶相關基因，發酵培養基中需要持續的選擇壓力，以免外源質粒的丟失，重組大腸桿菌合成番茄紅素的穩定性較差。但用重組大腸桿菌生產番茄紅素也有顯著的優勢，發酵周期短，48 h內即可完成發酵，發酵培養基價格低廉，發酵成本低。因此，提高重組大腸桿菌合成番茄紅素的穩定性是用重組大腸桿菌發酵生產番茄紅素的研究重點。用三孢布拉霉菌體發酵生產番茄紅素，菌體合成番茄紅素穩定性好，食品安全性較大腸桿菌高，但發酵周期長，需120 h以上才能完成發酵，耗氧量高，發酵培養基價格昂貴，發酵成本高。因此，降低發酵成本是用三孢布拉霉菌體發酵生產番茄紅素的研究重點。

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