葡萄酒澀感定量評價方法的建立

包賽依娜，李順琪，蘭義賓，潘秋紅*

（中國農(nóng)業(yè)大學 食品科學與營養(yǎng)工程學院 葡萄與葡萄酒研究中心，北京 100083）

澀感是評價葡萄酒質量的重要指標之一，葡萄酒中澀感來源于酒體中單寧酸與人體口腔唾液中蛋白的結合而產(chǎn)生的收斂性[1]。當前，對葡萄酒澀感的評價主要是通過品酒師的感官品評，沒有相對客觀的評價標準，受個體狀態(tài)、品評環(huán)境等的影響較大，同一酒樣不同批次的品評結果存在較大偏差，使得葡萄酒澀度難以被客觀分級[2-4]。如葡萄酒中糖、酸、酒精含量等可與單寧酸相互作用而影響品評者對澀感的感知，增加了感官品評的難度[4-8]；澀感的強弱也與酒在口中停留的時間和重復暴露的次數(shù)有關，它們可以影響樣品在嘴中的殘余和遺留[9-10]，需要一個有效的品嘗和口腔沖洗制度。因此，建立一個澀感的定量評價方法，可以在很大程度上提高葡萄酒質量評價的準確性。

前人的研究中，利用葡萄酒樣中單寧酸與白蛋白或牛血清白蛋白等結合，分析結合能力以指示澀度變化[11]，但是單純的蛋白質溶液體系并不能真實地反映口腔唾液環(huán)境與單寧酸發(fā)生的反應。口腔唾液中含有大量的電解質，離子種類和強度等都會對蛋白與單寧酸的結合產(chǎn)生影響[2]。口腔唾液模擬溶液由蛋白質、電解液等物質組成[2]。本試驗擬建立單寧酸與口腔唾液模擬溶液反應體系，探究單寧酸濃度、作用時間、溫度和蛋白濃度對結合反應的影響，建立葡萄酒澀度定量分析方法，為葡萄酒品質評價及澀感相關的理論研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 葡萄酒樣品

試驗所用的試材取自不同年份、不同產(chǎn)區(qū)和不同品種的葡萄酒，樣品信息如表1所示。每個樣品為750 mL，取其中50 mL用于澀度分析，剩余的用于感官品評。

表1 感官品評及澀度分析所用的葡萄酒Table 1 Wine samples for sensory evaluation and astringency analysis

1.1.2 化學試劑

氯化鉀、氯化鈉、氯化鎂（MgCl2·6H2O）、氟化鈉、磷酸二氫鉀（KH2PO4）、氯化鈣（CaCl2·2H2O）和磷酸氫二鉀（K2HPO4）均為分析純：北京化學試劑公司；蛋白胨和單寧酸（分析純）：美國Sigma-Aldrich公司；實驗室純凈水用Milli-Q（Millipore，Bedford，MA）純化水系統(tǒng)制得。

1.1.3 人體口腔模擬唾液的制備

人體口腔模擬唾液包括了電解質溶液和蛋白質母液兩類組分[2]。

電解質溶液的制備：稱取1.3 g 氯化鉀，0.1 g 氯化鈉，50 mg 氯化鎂（MgCl2·6H2O），0.1 g氯化鈣（CaCl2·2H2O），25 μg 氟化鈉，27 mg 磷酸二氫鉀 和35 mg 磷酸氫二鉀，用純凈水溶解，并定容至1 L。

蛋白母液的配制：用電解質溶液作為溶劑，配制3 g/L蛋白胨溶液即為蛋白母液。

1.1.4 單寧酸母液配制

單寧酸母液：用電解質溶液為溶劑，配制2 g/L為單寧酸母液。

1.2 儀器與設備

T6新世紀紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；GL-20G-II離心機：上海安亭科學儀器廠；XMTDA數(shù)顯調節(jié)恒溫水浴鍋：余姚市亞星儀器儀表有限公司；QL-901渦旋振蕩器：海門市貝爾儀器制造有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 澀度定量評價方法建立

以口腔模擬液中的電解質溶液為空白，對含單寧酸的電解質溶液進行全波長掃描，確定最大吸收峰波長。根據(jù)單寧酸與蛋白結合產(chǎn)生收斂性的原理，通過測定不同反應組在最大吸收峰波長下的吸光度值（OD）可判斷未結合的單寧酸含量，OD值越小，表明與蛋白結合的單寧酸量越多[11-12]，澀度越強。

將不同體積的單寧酸母液（2 g/L）與蛋白母液（3 g/L）混合，以電解液稀釋至6 mL，使蛋白質終質量濃度分別為0.05 g/L、0.10 g/L、0.50 g/L、1.00 g/L、1.50 g/L，單寧酸終質量濃度分別為0、0.1 g/L、0.2 g/L、0.3 g/L、0.4 g/L、0.5 g/L、0.6 g/L。每組兩個平行，分別在不同溫度（34 ℃、37 ℃、40 ℃）及不同水浴時間（0.5 h、1.0 h、2.0 h）反應。反應液常溫條件下離心（10 000 r/min、6 min）后，取上清液，在最大吸收峰波長下測定吸光度值。

以一定質量濃度的單寧酸與系列質量濃度的蛋白反應，用蛋白質量濃度對吸光度值作圖，獲得該質量濃度的單寧酸下曲線斜率。用不同質量濃度的單寧酸對其相應的曲線斜率作圖，得到單寧酸標準曲線。

1.3.2 樣品澀度檢測

以樣品代替單寧酸母液，按照1.3.1步驟，與梯度蛋白溶液反應，繪制波長330 nm處的吸光度值與蛋白質量濃度之間的對數(shù)曲線，得到其斜率，代入標準曲線，即可得到樣品的澀度值（用斜率絕對值表示）。

1.3.3 感官品評

葡萄酒品嘗、漂洗程序需要避免殘留和疲勞，這就要求品嘗者們在品嘗不同葡萄酒之前用果膠沖洗液漱口。果膠沖洗溶液用商業(yè)果膠以5 g/L的質量濃度制備。溶液在4 ℃條件下存儲，感官分析之前儲藏時間不超過3 d[1]。

品評者為15位經(jīng)過短暫培訓的中國農(nóng)業(yè)大學葡萄與葡萄酒工程專業(yè)學生（3男12女），年齡在20～22歲之間。在培訓課中主要介紹了每個屬性的感官方法和強度范圍，用單寧酸配制5個澀感梯度溶液，作為訓練樣本，讓品評者感知澀味屬性，并對澀感強弱進行界定，設定為5個澀感級別分別對應為分數(shù)值1、2、3、4、5。這5個溶液分別為：（1）體積分數(shù)為12%乙醇+0單寧酸；（2）體積分數(shù)為12%乙醇+0.2 g/L單寧酸；（3）體積分數(shù)為12%乙醇+0.4 g/L單寧酸；（4）體積分數(shù)為12%乙醇+0.6 g/L單寧酸；（5）體積分數(shù)為12%乙醇+0.8 g/L單寧酸。遵循先白后紅、先干后甜的順序進行品嘗。

2 結果與分析

2.1 檢測波長的確定

為了解在口腔模擬溶液中單寧酸的最大吸收波長，對含單寧酸的電解質溶液進行了全波長掃描，由圖1可知，在波長330 nm處有最大吸收值。這與前人的報道有所不同，如劉彥霞等[3，13-15]采用波長280 nm測定干紅葡萄酒的澀度，分析體系為水溶液，推斷可能是模擬口腔溶液的電解質組分導致單寧酸吸收峰發(fā)生偏移。在后續(xù)研究中，采用波長330 nm條件下測定反應體系中剩余單寧酸的含量。

圖1 單寧酸-口腔模擬液體系的全波長掃描Fig.1 Full wavelength scanning of tannin-oral model solution

2.1.1 反應溫度的確定

將不同質量濃度（0、0.1 g/L、0.2 g/L、0.3 g/L、0.4 g/L、0.5 g/L、0.6 g/L）的單寧酸與1.5 g/L的蛋白胨溶液混合，分別在34 ℃、37 ℃、40 ℃反應2 h，結果如圖2所示。

圖2 不同質量濃度單寧酸與蛋白質溶液(1.5 g/L)在不同溫度下反應時吸光度值的變化Fig.2 Changes of absorbance values of the reaction systems containing 1.5 g/L protein solution and different concentrations of tannins at different temperature

由圖2可知，37 ℃條件下單寧酸與蛋白結合呈現(xiàn)最好的線性關系，單寧酸與吸光度值的相關系數(shù)最大（R=0.994），曲線趨勢最為穩(wěn)定，考慮37 ℃也比較接近人體口腔溫度，因此在后續(xù)研究中，反應溫度設定在37 ℃。

2.1.2 作用時間的影響

37 ℃條件下0.5 g/L蛋白質溶液與不同質量濃度單寧酸（0、0.1 g/L、0.2 g/L、0.3 g/L、0.4 g/L、0.5 g/L、0.6 g/L）分別作用0.5 h、1.0 h和2.0 h，結果見圖3。

圖3 不同質量濃度單寧酸與蛋白質溶液(1.5 g/L)在不同時間下反應時吸光度值的變化Fig.3 Changes of absorbance values of the reaction systems containing 1.5 g/L protein solution and different concentrations of tannins at different temperature

由圖3可知，0.5 h和1.0 h的曲線波動較大，而作用時間2.0 h時，曲線呈線性且趨勢穩(wěn)定。由此推測作用時間2.0 h，單寧酸與蛋白已充分結合，綜合考慮時間利用率及完全反應情況，將該方法的作用時間設定為2.0 h。

2.1.3 蛋白質質量濃度的影響

葡萄酒中單寧酸含量一般為0.2～0.8 g/L[15]，普通型釀造工藝及常見葡萄品種的葡萄酒內單寧酸含量約為0.4 g/L左右。因此本試驗分析了0.4 g/L單寧酸與不同質量濃度（0.05～3 g/L）蛋白的結合反應，結果如圖4所示。

由圖4可知，蛋白質量濃度越大，與單寧酸結合的越多，剩余的單寧酸越少，吸光度值越小，蛋白質量濃度與吸光度值的變化呈一定的線性關系（R=0.987）。當少量的蛋白加入單寧酸溶液中時，蛋白質-單寧酸相結合，形成云狀沉淀[16]。起初單寧酸質量濃度相對于蛋白的質量濃度要高，因此所有的蛋白質都被一定量的單寧酸沉淀。即起始時波長330 nm處吸光度值迅速下降。然而，隨著加入蛋白量的增加，溶液中單寧酸的質量濃度變得越來越低直到完全消失。過量的蛋白不會沉淀，吸光度值下降并與蛋白質量濃度增加不呈線性關系。建立了蛋白質量濃度對數(shù)與吸光度值變化之間的關系，其相關系數(shù)R=0.992，表明用對數(shù)方程可以更好地反映蛋白與單寧酸反應曲線。

2.2 單寧酸質量濃度與曲線斜率之間的線性關系

單寧酸與口腔唾液蛋白結合生成收斂性物質，人可感知到澀感[1]。蛋白與單寧酸的結合能力越強，則澀感越強。對數(shù)曲線的斜率可以反映結合能力的大小，即斜率的絕對值越大，澀感越強，因此，樣品澀度的相對強弱可以用斜率大小來衡量。

根據(jù)一定質量濃度的單寧酸與一定質量濃度的蛋白反應所對應的吸光度值，獲得對數(shù)曲線的斜率，將不同質量濃度（0、0.1 g/L、0.2 g/L、0.3 g/L、0.4 g/L、0.5 g/L、0.6 g/L）單寧酸與不同質量濃度（0、0.05 g/L、0.1 g/L、0.5 g/L、1.0 g/L、1.5 g/L）蛋白反應所得到的對數(shù)曲線斜率作圖，得到單寧酸質量濃度與對數(shù)曲線的斜率絕對值之間的關系，結果見圖5。

圖5 對數(shù)曲線斜率絕對值與單寧酸初始質量濃度之間的線性關系Fig.5 Linear relationship between the slope of the logarithmic curve and the initial concentration of tannin

由圖5可知，該曲線可作為單寧酸標準曲線，用于衡量樣品澀度的相對強弱。曲線線性回歸方程為y=0.015 4x+0.012 4，兩者的相關性R達到0.972，表明它們呈現(xiàn)較好的線性關系。

2.3 感官品評結果與澀度定量評價方法檢測結果的相關性

基于上述確定的反應條件和標準曲線，分析了不同年份、不同品種和不同釀造工藝生產(chǎn)的葡萄酒樣品的澀度，并進行了感官品評，結果分別如圖6A、6B所示。除了酒樣14、15、16感官品評與定量評價沒有對應關系之外，其他樣品感官品評的分數(shù)越高，澀度越大，相應的曲線斜率的絕對值越高，澀度越大，兩者的相關性結果見圖6C。由圖6C可知，21個測試樣品感官品評與澀度定量評價之間的相關系數(shù)R達到0.918，線性回歸方程為y=-0.004 7x-0.006 7，表明本研究所建立的澀度定量評價方法與感官品評結果基本相符，可用于葡萄酒澀度的定量評價。

圖6 21個酒樣澀感的感官品評(A)及澀度定量評價(B)以及二者關系(C)Fig.6 Results of sensory evaluation (A),astringency quantitative evaluation (B) and their correlation (C) for 21 wine samples

3 結論

本研究建立的葡萄酒澀度定量檢測方法為：酒樣與不同質量濃度（0～3 g/L）蛋白在電解質溶液中，37 ℃作用2 h，常溫條件下10 000 r/min離心6 min，上清液在330 nm波長下檢測樣品吸光度值，所得的對數(shù)曲線的斜率大小可表示澀度大小，采用該方法定量檢測澀度結果與感官品評結果基本一致，其相關性為R=0.918。相比于傳統(tǒng)的感官品評將澀度主觀分級，該方法可定量葡萄酒澀度，克服了感官品評中個體差異、感官疲勞和其他呈味物質影響等因素造成的誤差，使分析結果更具科學性。此外，該方法也可用于大批量的酒樣澀度分析，使葡萄酒澀度分析變得快速簡便，并使不同批次酒樣分析具有可比性。

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