一種硬質蒙古干酪成分組成和風味化合物分析研究

李 博，張 亮，高 鑫

（1.上海工會管理職業學院 健康安全系，上海 201415；2.上海交通大學 醫學院，上海 200240）

干酪是一種營養價值很高的乳制品，其蛋白質消化率為96%～98%[1]。近年來，世界干酪產量一直保持著上升趨勢，2011年超過2 000萬t，每年大概有1/3的鮮乳被用于干酪生產。干酪生產地區主要分布在歐盟、北美、北非、大洋洲等[2]。在我國，干酪的發展正處于市場培育階段，人均消費量很低，還沒有形成大眾化的消費，其主要原因歸結于中國居民的飲食習慣、對奶酪的認知情況和消費能力[3-4]。各少數民族的干酪制品都各具特色，但這些傳統干酪基本上是家庭作坊式生產，沒有形成規模以及穩定的消費群體，對我國干酪市場發展的影響有限。因此，對干酪進行配方和工藝優化是發展我國干酪市場的重要方式。本研究對蒙古干酪的成分和風味化合物進行了分析，以期為蒙古干酪的工業化生產提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蒙古干酪于2014年9月購買于內蒙古鑲黃旗農貿市場，低溫儲藏備用；乳酸檢測分析試劑盒：美國BioVision公司；正構烷烴標準品：北京迪科馬科技有限公司；氨基酸標準液H：日本和光純薬工業株式會社；鹽酸標準液、氫氧化鉀標準液：上海化工研究院；實驗所用化學試劑均為分析純：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

FE20 pH計：瑞士梅特勒-托利多公司；50/30 μm Divinylbenzene/Carboxen/PDMS固相微萃取探針：美國Supelco公司；DB-5MS氣相色譜柱：百靈威科技有限公司；L-8900氨基酸全自動分析儀：日本Hitachi公司；7890A-5975C氣相色譜-質譜聯用儀：美國Agilent公司；LRH-70培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；SW-CJ-2FD無菌操作臺：上海博迅實業有限公司。

1.3 方法

1.3.1 基本成分分析

水分含量測定按照國際標準化組織（international stan dardization organization，ISO）5534—2004《干酪和加工干酪—總固體含量測定方法》進行測定；脂肪含量測定利采用羅紫-哥特里法；粗蛋白測定按照國標GB 5009.5—2010《食品中蛋白質的測定》，利用凱氏定氮法測定干酪中粗蛋白含量；灰分采用美國分析化學家協會（association of official analytical chemists，AOAC）935.42方法進行測定；酸度測定：取5 g樣品和45 mL去離子水混合后經過高速（5 000 r/min）均質1 min，混勻后用pH計進行測量；乳酸含量測定使用乳酸檢測分析試劑盒進行測定，操作步驟按照使用說明書進行；食鹽含量測定按照佛爾哈德（Volhard）方法[5]；鈣的測定利用原子吸收光譜法[6]。所有實驗重復3次，取平均值。

1.3.2 可溶性氮及氨基酸含量的測定

pH 4.6-可溶性氮（Soluble nitrogen，SN）的測定[7]：準確稱取1.00 g干酪加入50 mL離心管中，向離心管中加入25 mL pH 4.6的乙酸鹽緩沖液，溶解后，以4 000 r/min離心20 min，取上清液移入消化管內，測定含氮量（%）。

12%三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）-可溶性氮（SN）的測定：準確稱取1.50 g干酪，加入25 mL 12%TCA溶液，充分磨碎后，懸浮液以4 000 r/min離心20 min，取上清液定量地移入消化管內，測定含氮量（%）。

游離氨基酸的測定[8]：準確稱取1.00 g干酪，用超純水充分溶解后定容至5 mL，以4 000 r/min離心20 min。取1 mL上清液，加入2倍體積12% TCA溶液，充分混勻，-20 ℃冷凍靜置15 min；然后在4 ℃、10 000 r/min離心15 min，取上清液；用0.22 μm濾膜過濾樣品；調整樣品pH值為2.0（用0.02 mol/L的鹽酸作為基準）。通過全自動氨基酸分析儀對游離氨基酸進行檢測分析。分析條件：標準溶液：氨基酸標準液類型H；氨基酸分離柱（4.6 mm×60 mm），日立離子交換樹脂柱（粒徑3 μm）；進樣量：20 μL；檢測波長：570 nm（VIS 1）、440 nm（VIS 2）。

1.3.3 揮發性風味化合物的測定[9-10]

5.00g蒙古干酪樣品放入20 mL頂空進樣瓶內，加入5 mL 25%NaH2PO4，在50 ℃的超聲波水浴中平衡30 min。將已經老化的50/30 μm Divinylbenzene/Carboxen/PDMS固相微萃取（solid-phase micro-extraction，SPME）探針插入到頂空進樣瓶的頂空內進行固相微萃取，吸附30 min后，拔出探針插入到進樣器內在250 ℃進行解吸，解吸后用氣質聯用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）儀進行分析。

全域旅游(comprehensive tourism)最早由歷新建、張凌云等人于2013年在《人文地理》上提出概念，并構建了基本框架。2016年國家旅游局局長李金早提出：全域旅游是指在一定區域內，以旅游業為優勢產業，通過對區域內資源尤其是旅游資源、相關產業、生態環境、公共服務、體制機制、政策法規、文明素質等進行全方位、系統化提升，實現區域資源有機整合、產業融合發展、社會共建共享，以旅游業帶動和促進經濟社會協調發展的一種新的區域協調發展理念與模式。

SPME的條件：溫度120 ℃；加熱時間25 min，萃取時間15 min；加熱振蕩速度250 r/min，萃取振蕩速度250 r/min；解吸時間3 min。

GC條件：色譜柱DB-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；柱溫40 ℃保持10 min，以5 ℃/min升至240 ℃，以20 ℃/min升至280 ℃，保持8 min。進樣口溫度250 ℃；載氣He，流速1.0 mL/min，分流比3∶1。

MS條件：傳輸線溫度280 ℃；離子源溫度230 ℃；四級桿溫度50 ℃；電離方式：電子電離（electron ionization，EI）源，電子能量：70 eV；掃描方式：全掃描；掃描范圍20～400 m/z，溶劑延遲3.5 min；標準譜庫：美國國家標準技術研究所（national institute of standards and technology，NIST）2011譜庫。

1.3.4 統計分析

試驗結果以平均值±標準差來表示，用SPSS 19.0軟件對所獲得的結果進行統計分析，顯著性檢驗采用方差分析（analysis of variance，ANOVA）程序中的Duncan法，P＜0.05即差異顯著。

2 結果與分析

2.1 基本成分分析結果

表1 蒙古干酪基本成分分析結果Table 1 Chemical components analysis results of Mongolian cheese

蒙古干酪基本成分分析結果見表1。由表1可知，蒙古干酪的水分含量為24.13%，符合硬質干酪的水分要求。干酪的生化反應需要水分的參與，當干酪水分含量較低時，其和酪蛋白的水合作用減少，使得干酪在儲藏期間不利于酪蛋白的水解[11]。蒙古干酪在制作時需要進行攪拌去除部分奶油，因此，蒙古干酪中脂肪含量較低，大概在10.24%左右。較低的脂肪含量使得蒙古干酪在儲藏過程中減少脂肪氧化所帶來的異味，利于干酪儲藏。蒙古干酪的pH值為3.57，屬于偏酸性。L-乳酸是蒙古干酪中較為重要的一種有機酸，乳酸的產生可以使原料奶在發酵過程中pH值降低，產生凝乳[12]。蒙古干酪中L-乳酸的含量達到了2.51 g/kg干酪，D-乳酸含量為1.11 g/kg干酪。D-乳酸和L-乳酸可以進行消旋作用，DEIANA P等[13]在研究混合發酵劑制作羅馬羊奶酪（Pecorino romano）干酪中過程中乳酸和乙酸的代謝時，也發現了這種情況。蒙古干酪的粗蛋白質含量為52.45%，屬于高蛋白質含量干酪，是內蒙古草原牧民攝取蛋白質的重要來源之一。蒙古干酪中的鈣含量是0.73%，屬于高鈣食品，這也是蒙古草原牧民鈣來源的主要食物種類之一。食鹽含量為2.24%，含量較高，能夠抑制雜菌生長，延長蒙古干酪的儲藏期。

2.2 可溶性氮及氨基酸分析結果

蛋白質水解是蒙古干酪儲藏時發生的重要生化變化，其對風味有直接貢獻，如肽和氨基酸等，但是如果保存條件不當也會導致異味產生。同時，所產生的肽和氨基酸等具有更高的營養作用[14]。

pH 4.6-SN含量反映干酪中蛋白質水解程度，pH 4.6-SN含量越高，說明蛋白質水解程度越高。在蒙古干酪中，pH 4.6-SN含量為6.32%，其蛋白質水解程度約有12.05%。12%TCA-SN為干酪中的非蛋白氮，是判斷干酪成熟程度的重要參數之一[15]。在蒙古干酪中，TCA-SN含量為2.32%。由于蒙古干酪水分含量低，微生物生命活動較弱，其蛋白質水解程度及干酪成熟程度較低。

游離氨基酸是很多風味化合物（如胺、羧酸、硫醇、酯、醇、醛和硫酯等）的前體物質，同時，某些氨基酸本身就帶有一定的味道，如精氨酸（Arg）具有苦味，脯氨酸（Pro）、絲氨酸（Ser）和天冬酰胺（Asn）具有甜味等[16]。蒙古干酪中的游離氨基酸的色譜圖見圖1，組成如表2所示。

圖1 蒙古干酪中游離氨基酸的色譜圖Fig.1 Chromatogram of free amino acids in Mongolian cheese

表2 蒙古干酪中游離氨基酸的組成Table 2 Composition of free amino acids of Mongolian cheese

由表2可知，在檢測到的17種氨基酸中，脯氨酸（Pro）、谷氨酸（Glu）、苯丙氨酸（Phe）、鳥氨酸（Orn）、亮氨酸（Leu）和丙氨酸（Ala）、賴氨酸（Lys）的含量較高。而蘇氨酸（Thr）和精氨酸（Arg）的含量較低，均＜1 mg/kg干酪。必需氨基酸中，除色氨酸和甲硫氨酸沒有檢測到外，其他6種都有檢測到，其含量約占氨基酸總量的30%。

2.3 揮發性風味化合物分析結果

通過SPME-GC-MS方法對蒙古干酪中的風味化合物進行分析，GC-MS總離子流色譜圖見圖2，各成分鑒定結果見表3。

圖2 蒙古干酪的氣相色譜-質譜總離子流色譜圖Fig.2 Total ion chromatogram of aroma components of Mongolian cheese by GC-MS

表3 蒙古干酪揮發性風味化合物測定結果Table 3 Determination results of volatile compounds isolated from Mongolian cheese

由表3可知，蒙古干酪中一共檢出15種化合物：4種羧酸類、3種醇類、7種酯類和1種其他類化合物。

羧酸是干酪渾發性風味物質中的主要化合物，己酸、辛酸、癸酸和月桂酸是蒙古干酪中4種羧酸，作為中長鏈酸其多為甘油三酯的水解產物[17]。羧酸占到整個揮發性化合物的54.48%，癸酸和辛酸是分離到較多的2種羧酸。4種羧酸均是偶數鏈的游離脂肪酸，其閾值較低，但每種羧酸都有自己特殊的香味。如己酸被認為是一種由溫和到強烈過渡的酸，具有山羊奶般的味道，辛酸有“蠟”、“肥皂”的味道，癸酸有“蠟”、“甜”的味道，月桂酸有著“肥皂水”的味道等。在很多干酪中，它們都是干酪風味的重要組成部分。如己酸在林堡（Limburger）干酪[18]、阿根廷巴馬（Reggianito Argentino）干酪[19]和費歐洛沙多乳酪（Fiore sardo）干酪[20]也被認為是主要的風味物質。辛酸和癸酸是榮可（Roncal）干酪的主要風味成分[21]。

醇類有1-戊醇、2-甲基丁醇和苯乙醇，約占蒙古干酪整個風味化合物總量的10.76%，其中，苯乙醇含量最高。苯乙醇，具有玫瑰花味，和苯乙酸乙酯在一起可以產生可感知的花香累積效應，是干酪重要的風味特征之一。

酯類約占蒙古干酪風味化合物總量的34.23%，由于酯類在常溫下易揮發，即使在較低濃度下也呈現風味特征。酯類主要有水果味，可以減少脂肪酸的酸味和氨基酸產生的苦味。在所分離到的酯類中，乙酸乙酯的生成量最大，然后是乙酸苯乙酯和辛酸乙酯。在干酪中，由苯丙氨酸產生的乙酸苯乙酯具有玫瑰花的香味，可以給予蒙古干酪愉快的花香味[22]。

3 結論

本試驗對蒙古干酪的成分和風味進行了研究。蒙古干酪的水分含量為24.13%，脂肪含量為10.24%，粗蛋白質含量為52.45%，pH值為3.57，符合其低水分、低脂、高蛋白、偏酸性的特點。在分離到的17種游離氨基酸中，Pro、Glu、Phe、Orn、Leu、Lys和Ala的含量較高。對于蒙古干酪風味成分來講，共檢出15種風味化合物，其中羧酸類是主要的風味化合物，約占總量的54.48%，癸酸和辛酸是分離到較多的2種羧酸。醇類約占總量的10.76%，苯乙醇含量最高，和苯乙酸乙酯一起為蒙古干酪提供花香累積效應。酯類約占總量的34.23%，乙酸乙酯含量最高，然后是乙酸苯乙酯和辛酸乙酯。對蒙古干酪進行成分組成和風味化合物分析，為蒙古干酪的規模化生產提供理論基礎。

[1]周海珍，李開雄，蘇中偉，等.干酪生產用發酵劑的篩選[J].中國釀造，2009，28（6）：80-82.

[2]滕國新，周偉明.中國干酪及乳清制品的現狀與產業化進程[J].食品工業科技，2000，21（1）：76-78.

[3]趙秀玲.考量中國的奶酪市場[J].中國奶牛，2009（6）：43-45.

[4]王丁棉.奶酪在中國的發展現狀及對策[J].食品工業科技，2006，27（8）：11-14.

[5]HAOUET M N,ALTISSIMI M S,FRAMBOAS M,et al.Validation of the Volhard method for chloride determination in food[J].Accredit Qual Assur,2006,11(1):23-28.

[6]KIRK S,SAWYER R.Pearson’s composition and analysis of foods[M].London:Longman Group Ltd.,1991.

[7]賈宏信，龔廣予.干酪乳桿菌LC2W 對切達干酪蛋白質降解的影響[J].江蘇農業科學，2013，41（12）：261-264.

[8]謝愛英，黨亞麗，張稅利，等.不同方法促熟干酪成熟期間微生物及氨基酸研究[J].食品科學，2014，35（19）：180-184.

[9]DELGADO F J,GONZáLEZ-CRESPOA J,CAVA R,et al.Characterisation by SPME-GC-MS of the volatile profile of a Spanish soft cheese PDO Torta del Casar during ripening[J].Food Chem,2010,118(1):182-189.

[10]田懷香，衣字佳，鄭小平.同時蒸餾萃取與氣相色譜-質譜法分析國產干酪揮發性風味物質[J].食品工業科技，2009，30（4）：73-76.

[11]雷蕾，任發政，任星環.不同凝乳時間對Mozzarella 干酪品質的影響[J].食品科學，2005，25（12）：55-58.

[12]潘艷虹，劉冬梅，何葉子.手性柱色譜法測定酸奶及乳酸飲料中的L-乳酸及D-乳酸[J].中國乳品工業，2010，38（5）：49-52.

[13]DEIANA P,FATICHENTI F,FARRIS G A,et al.Metabolization of lactic and acetic acids in Pecorino Romano cheese made with a combined starter of lactic acid bacteria and yeast[J].Le Lait,1984,64(640-642):380-394.

[14]顧瑞霞，謝繼志.干酪制造和成熟過程中的蛋白質水解[J].中國乳品工業，1992，20（1）：24-28.

[15]TAVARIA F K,FRANCO I,CARBALLO F J,et al.Amino acid and soluble nitrogen evolution throughout ripening of Serra da Estrela cheese[J].Int Dairy J,2003,13(7):537-545.

[16]IZCO J M,TORRE P.Characterisation of volatile flavour compounds in Roncal cheese extracted by the‘purge and trap’method and analysed by GC-MS[J].Food Chem,2000,70(3):409-417.

[17]KARALI F,GEORGALA A,MASSOURA T,et al.Volatile compounds and lipolysis levels of Kopanisti,a traditional Greek raw milk cheese[J].J Sci Food Agr,2013,93(8):1845-1851.

[18]WOO A,KOLLODGE S,LINDSAY R.Quantification of major free fatty acids in several cheese varieties[J].J Dairy Sci,1984,67(4):874-878.

[19]WOLF I,PEROTTI M C,BERNAL S M,et al.Study of the chemical composition,proteolysis,lipolysis and volatile compounds profile of commercial Reggianito Argentino cheese:Characterization of Reggianito Argentino cheese[J].Food Res Int,2010,43(4):1204-1211.

[20]URGEGHE P P,PIGA C,ADDI M,et al.SPME/GC-MS characterization of the volatile fraction of an Italian PDO sheep cheese to prevalent lypolitic ripening:the case of Fiore Sardo[J].Food Anal Methods,2012,5(4):723-730.

[21]CURIONI P,BOSSET J.Key odorants in various cheese types as determined by gas chromatography-olfactometry[J].Int Dairy J,2002,12(12):959-984.

[22]KUB KOVá J,GROSCH W.Evaluation of potent odorants of Camembert cheese by dilution and concentration techniques[J].Int Dairy J,1997,7(1):65-70.