響應曲面法優(yōu)化牛奶中雌二醇的微波提取工藝

曹玉林，吳林昊，丁郭影，胡琪琳，薛秀恒，*，王志耕

（1.安徽農業(yè)大學茶與食品科技學院，安徽農產品加工工程實驗室，安徽合肥230036；2.安徽中青檢驗檢測有限公司，安徽合肥230088）

響應曲面法優(yōu)化牛奶中雌二醇的微波提取工藝

曹玉林1，2，吳林昊1，丁郭影1，胡琪琳1，薛秀恒1，*，王志耕1

（1.安徽農業(yè)大學茶與食品科技學院，安徽農產品加工工程實驗室，安徽合肥230036；2.安徽中青檢驗檢測有限公司，安徽合肥230088）

為優(yōu)化牛奶中雌二醇的微波提取工藝，在單因素實驗的基礎上，利用響應曲面法考察液料比、微波功率和微波時間對雌二醇提取率的影響，優(yōu)化提取工藝。結果表明：牛奶中雌二醇微波提取的優(yōu)化工藝條件為：液料比4.1∶1，微波功率475 W，微波時間61 s。在此條件下，雌二醇的最高提取率為92.77%。與超聲提取方法相比，微波提取工藝具有提取時間短，得率高，能耗低，環(huán)保等優(yōu)點。

牛奶，雌二醇，微波提取，響應曲面法

在人類眾多的食品中，牛奶占有特殊的地位，其富含蛋白質、脂肪、維生素等多種營養(yǎng)成分，具有很高的營養(yǎng)價值，倍受人們青睞[1-2]。但是在奶牛飼養(yǎng)過程中，來源于飼料或牛體自身分泌的雌激素可能富集于牛奶中，導致牛奶中雌激素超標[3]。雌激素是一類可直接影響動物的代謝與繁殖，具有相似化學結構的類固醇激素。該類物質進入機體后，可干擾體內正常分泌物的合成、釋放、運轉、代謝及結合，激活或抑制內分泌系統(tǒng)功能，最終造成機體代謝調控紊亂[4-6]。雌激素主要有三種類型：雌酮、雌二醇和雌三醇，其中雌二醇的活性最強[7]。

微波萃取技術是將被萃取的原料浸于某選定的溶劑中，通過微波反應器發(fā)射微波能，使原料中的化學成分迅速溶出的技術和方法。微波萃取技術具有操作簡便、經(jīng)濟、省時等優(yōu)點，同時可以提高目標物質的回收率和純度[8-10]。

隨著雌激素殘留問題日益受到重視，各種針對牛奶中雌激素的提取技術迅速發(fā)展。目前，提取牛奶中雌激素的方法有常規(guī)溶劑法[11]和超聲波法[12]，耗時長、成本高，且尚未見微波法提取牛奶中雌激素的研究報道。為此，本文研究了微波技術提取牛奶中雌二醇，此方法不僅得率高而且提取時間短，能耗低，可以為今后牛奶中雌激素的研究提供前處理依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雌二醇標準品 Sigma公司；乙酸乙酯、甲醇、乙腈 國藥集團化學試劑有限公司，分析純；乙腈 美國飛世爾科技公司，色譜純；鮮牛奶 安徽新希望白帝乳業(yè)有限公司，初檢不含雌二醇。

Waters1525高效液相色譜系統(tǒng) 配有紫外檢測器2489和Breeze2色譜工作站，美國Waters公司；SAM-255型微波系統(tǒng) 美國CEM公司；MS105DU梅特勒-托利多電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Allegra-64R型BECKMAN離心機 美國貝克曼公司；KQ3200DE型數(shù)控超聲清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；R201型旋轉蒸發(fā)儀 上海申勝生物技術有限公司；HH-S恒溫水浴鍋 江蘇國勝實驗儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品的制備 按5 mg/L向牛奶中分別加入雌二醇標準品，攪拌混勻，室溫下靜置30 min，得到樣品牛奶。

1.2.2 雌二醇的微波提取工藝 準確吸取5 mL樣品牛奶于三角燒瓶中，加入提取溶劑混勻，微波提取，取出后，將樣液轉移至離心管，以4000 r/min離心10 min，吸出上清液過無水硫酸鈉后轉移至旋轉蒸發(fā)瓶，殘渣用提取溶劑重復提取2次，上清液過無水硫酸鈉后合并于旋轉蒸發(fā)瓶，50℃旋蒸至近干，用5 mL提取溶劑洗滌蒸發(fā)瓶，將樣液轉移至濃縮管中，于50℃水浴揮發(fā)至近干，用甲醇定容至1 mL，過0.45 μm微孔濾膜，進行HPLC分析，計算提取率。

高效液相色譜條件：色譜柱：Symmetry C18柱（3.5 μm，75 mm×4.6 mm Column）；檢測波長：280 nm；柱溫：40℃；流速：1.0 mL/min；流動相：乙腈∶水（50∶50，V/V）；保持10 min，進樣量10 μL[13]。

雌二醇提取率計算：X=S1/S2

式中：X為雌二醇提取率（%）；S1為樣品牛奶中雌二醇標準品經(jīng)微波提取測得的峰面積；S2為與樣品中同等濃度的雌二醇標準品甲醇溶液測得的峰面積。

1.2.3 最佳提取溶劑的選擇 為了選擇雌二醇的最佳提取溶劑，吸取樣品牛奶后，分別加入乙腈、甲醇和乙酸乙酯，按1.2.2操作，計算提取率，將提取率最高者確定為最佳提取溶劑。

1.2.4 單因素實驗設計 按1.2.2雌二醇的微波提取工藝，采用乙腈作為提取劑，在固定微波功率為450 W、提取時間60 s的前提下，液料比（mL∶mL）分別為2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1；在固定液料比4∶1、提取時間60 s的前提下，微波功率分別為250、350、450、550、650 W；在固定液料比4∶1、微波功率450 W的前提下，微波時間分別為20、40、60、80、100 s，考察各組實驗在微波提取結束后，樣品中雌二醇標準品的提取率，從而確定適宜的取值范圍。

1.2.5 響應面實驗設計 在單因素實驗的基礎上，以液料比、微波功率和微波時間為自變量，微波提取結束后，牛奶中雌二醇標準品的提取率為響應值，利用響應面分析法優(yōu)化牛奶中雌二醇的微波提取工藝，因素水平如表1。

表1 響應面實驗因素水平編碼表Table 1 Factors and levels of the response surface experiment

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 所有數(shù)據(jù)利用Microsoft Excel進行統(tǒng)計處理，使用Design Expert 8.0軟件進行響應面實驗設計，對實驗數(shù)據(jù)進行回歸分析，繪制響應效應圖。

2 結果與分析

2.1 最佳提取溶劑的選擇

由圖1可知，不同種類的提取溶劑對雌二醇的提取率影響顯著（p＜0.05），雌二醇在乙腈中的提取率最高，優(yōu)于甲醇和乙酸乙酯，同時乙腈作為提取劑對被測組分具有良好的溶解性，又是較好的蛋白質沉淀劑[14]。因此本實驗選用乙腈為牛奶中雌二醇的提取劑。

圖1 不同種類提取劑對雌二醇提取率的影響Fig.1 The influence of different extraction agent on extraction yield of extradiol

2.2 單因素實驗

2.2.1 液料比對雌二醇提取的影響 由圖2可知，雌二醇提取率隨著液料比的增加而增大，當液料比從2∶1增加到4∶1時，提取效果明顯提高，這可能是因為溶劑添加量越大，越有利于雌二醇溶出，其提取率就越高。但是繼續(xù)增加液料比時，由于雌二醇的提取逐漸達到平衡，此時提取率增加緩慢。綜合考慮，選取液料比為4∶1。

2.2.2 微波功率對雌二醇提取的影響 由圖3可知，在微波功率250～450 W范圍內，雌二醇提取率隨著功率的增大而提高，微波功率增加導致物質加熱程度增加，蛋白質結構被破壞，與蛋白質結合的雌二醇被釋放出來進入提取溶劑，從而使提取率升高[15]。但是在微波功率達到450 W之后，提取率呈下降趨勢，這可能是因為高微波功率導致的熱效應使雌二醇遭到破壞[4]。綜合考慮，選取微波功率為450 W。

圖3 微波功率對雌二醇提取率的影響Fig.3 The influence of microwave power on extraction yield of extradiol

2.2.3 微波時間對雌二醇提取的影響 由圖4可知，雌二醇提取率在微波處理60 s時達到最大值。隨著微波時間的延長，雌二醇提取充分，繼續(xù)增加微波時間，溫度升高，破壞雌二醇，提取率下降[4]。綜合考慮，選取微波時間為60 s。

圖4 微波時間對提取率的影響Fig.4 The influence of microwave time on extraction yield of extradiol

2.3 響應面實驗結果與分析

2.3.1 響應面實驗結果 以液料比、微波功率和微波時間為自變量，牛奶中雌二醇標準品的提取率為因變量，采用Box-Behnken設計原理對牛奶中雌二醇的微波提取工藝參數(shù)進行優(yōu)化，實驗結果見表2。

表2 響應面實驗設計及結果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

對表2中實驗數(shù)據(jù)進行分析，得到響應面回歸擬合方程：

Y=92.22＋1.76A＋2.37B-1.26C-2.10AB＋2.40AC＋2.75BC-2.55A2-2.15B2-2.72C2

由表3可知，所得回歸方程極顯著（p＜0.01），方程的決定系數(shù)R2為0.9678，校正決定系數(shù)R2Adj為0.9263，且失擬項不顯著（p＞0.05），說明此方程對實驗的擬合度比較好。因此所獲得的二次多項模型有效，實驗方法可靠，可用該回歸方程代替實驗真實點對實驗結果進行分析和預測。微波時間對雌二醇提取率影響顯著（p＜0.05），液料比與微波功率對雌二醇提取率影響極顯著（p＜0.01）。液料比與微波功率、液料比與微波時間及微波功率與微波時間對雌二醇提取率均有極顯著（p＜0.01）的交互影響。

表3 回歸方程方差分析表Table 3 Analysis of variance for the response surface regression equation

2.3.2 實驗因素交互作用分析 將其中一個因素設為零水平，其他兩個因素交互作用的響應面見圖5～圖7所示。

由圖5可知，當微波時間為60 s時，液料比和微波功率的交互作用對雌二醇提取率的影響。微波時間固定不變時，牛奶中雌二醇的提取率隨著液料比的增加而升高，隨著微波功率的增加呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢；比較曲線的變化程度，微波功率對雌二醇提取率的影響較大，曲面的傾斜度比較陡[16]。

圖5 液料比與微波功率對雌二醇提取率影響的響應面圖Fig.5 Response surface plot of liquid-material ratio and microwave power on extraction yield of extradiol

由圖6可知，當液料比為4∶1時，微波功率和微波時間的交互作用對雌二醇提取率的影響。液料比固定不變時，牛奶中雌二醇的提取率隨著微波功率與微波時間的增加均呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢；比較曲線的變化程度，微波功率對雌二醇提取率的影響較大，曲面的傾斜度比較陡。

圖6 微波功率與微波時間對雌二醇提取率影響的響應面圖Fig.6 Response surface plot of microwave power and microwave time on extraction yield of extradiol

圖7 液料比與微波時間對雌二醇提取率影響的響應面圖Fig.7 Response surface plot of liquid-material ratio and microwave time on extraction yield of extradiol

由圖7可知，當微波功率為450 W時，液料比和微波時間的交互作用對雌二醇提取率的影響。微波功率固定不變時，牛奶中雌二醇的提取率隨著液料比與微波時間的增加均呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢；比較曲線的變化程度，液料比對雌二醇提取率的影響較大，曲面的傾斜度比較陡。

2.3.3 模型的驗證 由Design-Expert 8.0軟件分析得到牛奶中的雌二醇的最佳微波提取工藝是：液料比4.1∶1、微波功率475.5 W、微波時間61.5 s，此條件下牛奶中雌二醇提取率的理論值為92.94%。考慮實際可操作性，選擇液料比為4.1∶1、微波功率為475 W、微波時間為61 s，對模型進行驗證實驗，3次平行驗證實驗雌二醇提取率平均值為92.77%，與理論值接近，實際值和預測值之間相對誤差較小，在可接受范圍之內，說明采用響應曲面法優(yōu)化牛奶中雌二醇微波提取工藝可靠，具有使用價值。

2.4 微波法與超聲波法的比較

超聲波法[12]提取牛奶中雌二醇，提取時間60 min、超聲功率250 W、液料比1∶10、乙醇濃度80%、提取溫度70℃，與本實驗所得最佳提取工藝進行比較，結果見表4。與超聲波法相比，利用微波法提取雌二醇，提取率高，而且微波提取法用時短，可能是因為微波法加速破壞蛋白質結構，使雌二醇游離，所以微波法提取牛奶中雌二醇效率高于超聲波法。

表4 微波法與超聲波法的比較Table 4 Contrast of microwave extraction method and ultrasonic extraction method

3 結論

本實驗通過微波技術提取牛奶中的雌二醇，通過單因素實驗以及響應面分析方法對微波提取工藝進行優(yōu)化，確定微波提取牛奶中雌二醇的最佳工藝為液料比4.1∶1、微波功率475 W、微波時間61 s，在最優(yōu)工藝條件下雌二醇提取率達到92.77%，該提取工藝可為今后牛奶中雌激素分析檢測前處理方法提供參考。

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Optimization of microwave extraction of estradiol in milk by response surface methodology

CAO Yu-lin1，2，WU Lin-hao1，DING Guo-ying1，HU Qi-lin1，XUE Xiu-heng1，*，WANG Zhi-geng1
（1.School of Tea and Food Science&Technology，Anhui Agriculture University，Engineering Laboratory of Agricultural Products Processing of Anhui，Hefei 230036，China；2.Auhui Zhongqing Inspection and Testing Co.，Ltd.，Hefei 230088，China）

The extraction process of estradiol from milk was investigated in this paper.Based on single factor experiments，response surface methodology was used to explore the effects of liquid-material ratio，microwave power and microwave time on extraction yield of estradiol.The results showed that the optimal conditions for the extraction of estradiol were the liquid-material ratio of 4.1∶1，microwave power of 475 W，microwave time of 61 s.Under the optimal extraction conditions，the highest extraction rate of estradiol was up to 92.77%.Compared with the ultrasonic extraction method，microwave extraction method had short extraction time，high extraction yield，low energy consumption，environmental protection and other advantages.

milk；estradiol；microwave extraction；response surface methodology

TS252.7

B

1002-0306（2015）22-0252-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.22.044

2015－03－16

曹玉林（1990-），男，在讀碩士研究生，研究方向：動物性食品加工與安全檢測，E-mail：caoyulin0721@163.com。

*通訊作者：薛秀恒（1971-），男，博士，副教授，研究方向：動物性食品加工與安全檢測，E-mail：xuexiuheng@126.com。

安徽省自然科學基金項目（11040606M91）；安徽省實驗區(qū)和試點省專項基金項目（12z0102055）。