ChIFN－γ釀酒酵母工程菌粉的毒性與營養(yǎng)分析

劉 宗，宋 莉，2* ，趙德剛，2*

(1.貴州大學農業(yè)生物工程研究院，山地植物資源保護與種質創(chuàng)新省部共建教育部重點實驗室，生命科學學院，貴州 貴陽 550025;2.山地生態(tài)與農業(yè)生物工程協同創(chuàng)新中心，貴州 貴陽 550025)

雞 γ －干擾素(Chicken interferon gamma，ChIFN－γ)具有免疫調節(jié)、抗病毒、抗腫瘤、增強疫苗免疫及抗球蟲等作用［1］。γ－干擾素(interferon gamma，IFN－γ)通過促進NK細胞的殺傷活性［2］，以及誘導病毒感染的細胞表達病毒抗原，增加免疫系統識別和殺傷感染細胞的能力等途徑實現其生物學功能［3］。酵母營養(yǎng)豐富，蛋白質和必需氨基酸含量高，廣泛應用于畜牧業(yè)中5，6］。利用酵母菌作為宿主表達生產干擾素具有培養(yǎng)控制容易，生長繁殖迅速，生產成本低廉，安全性高，表達產物具有活性和穩(wěn)定性［4］等優(yōu)勢。飼用酵母污染化學物質和致病微生物后，會導致品質變劣和畜禽中毒甚至死亡［7，8］。飼料霉菌污染每年給全球造成的經濟損失可達數千億美金［9］。感官性狀以及重金屬和微生物等衛(wèi)生學指標，可以有效反映飼料酵母的質量，關系到飼料安全、動物養(yǎng)殖、食品安全和人類健康。本研究對實驗室前期獲得的ChIFN－γ釀酒酵母工程菌進行干粉制備并對其安全性及營養(yǎng)價值進行評價分析，為進一步開發(fā)利用ChIFN－γ微生態(tài)飼料添加劑提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

野生型釀酒酵母菌株INVSC1購自Invitrogen公司，攜帶ChIFN－γ基因的INVSC1/pYE－IFNG重組酵母工程菌株由本實驗室創(chuàng)制。

1.2 方法

1.2.1 酵母工程菌粉制備 INVSC1/pYE－IFNG釀酒酵母工程菌的培養(yǎng)和目標蛋白誘導表達操作參見相關文獻［10］。誘導表達后的工程菌液按1500×g、4℃離心5 min，細胞沉淀用500μL滅菌水重懸后再用10000 r/min離心30 s，得到的細胞按建立的低溫冷凍干燥體系(另文發(fā)表)加入保護劑進行重組工程菌干粉制備。

1.2.2 菌種形態(tài)鑒別 將重組工程菌干粉進行復性和活化，接種到麥芽汁液體培養(yǎng)基和麥芽汁固體培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)3 d后，觀察其生長情況和顯微形態(tài)。

1.2.3 感官指標分析 取100 g樣品置于干凈白色紙片上，觀察其色澤、形態(tài)、有無雜質和異味。

1.2.4 酵母活細胞數測定 采用血球計數板法測定酵母活細胞數，具體操作參照GB/T 22547－2008進行。

1.2.5 毒性指標測定 分別按GB/T 13091－2002、GB/T 13093 －2006、GB/T 13092 －2006、GB/T 13080－2004、GB/T 13079－2006方法，對重組釀酒酵母工程菌粉中的沙門氏菌、細菌總數、霉菌、鉛、總砷等衛(wèi)生學指標進行測定。

1.2.6 營養(yǎng)成分測定 分別參照飼料的粗蛋白質(GB/T 6432－1994)、粗脂肪(GB/T 6433－2006)、粗纖維(GB/T 6434－2006)、水分和其他揮發(fā)性物質含量(GB/T 6435－2006)、粗灰分(GB/T 6438－2007)、淀粉(GB/T 20194－2006旋光法)、總糖(GB/T 15672－2009)、總磷(GB/T 6437－2002分光光度法)、鈣(GB/T 6436－2002)氨基酸(GB/T 16631－2008)等方法，對工程菌粉的營養(yǎng)指標進行測定。

1.2.7 蛋白質營養(yǎng)分析 采用FAO/WHO模式和全蛋模式［11］，通過氨基酸評分(Amino Acid Score，AAS)［12］、化學評分(Chemical Score，CS)、必需氨基 酸 指 數 (Essential Amino Acid Index，EAAI)［13，14］、氨基酸比值系數分(Score of RCAA，SRCAA)［11，15］、必需氨基酸相對比值(Essential A-mino Acid Relative Ratio，EAARR)16－18］等多個指標綜合評價工程菌粉的蛋白質品質。相關計算公式如下:

AAS=(樣品蛋白質中某一種必需氨基酸的含量/參考蛋白質模式中相應必需氨基酸含量)×100(比值較低者為限制性氨基酸，其AAS值就是該氨基酸分)

CS=(樣品蛋白質中某一必需氨基酸的相對含量/參考蛋白模式中相應必需氨基酸的相對含量)×100(比值較低者為限制性氨基酸，其CS值就是該化學分)

EAAI=［(ThrP/ThrS)×(ValP/ValS)×……×(LaysP/LysS)］∧(1/n)×100(p為樣品蛋白;s為參考蛋白;n為比較的必需氨基酸個數)

RC=待測蛋白質中某一種必需氨基酸的含量(g/100 g pro)/參考蛋白質模式中相應必需氨基酸含量(g/100 g pro)

RCAA=氨基酸比值/氨基酸比值之均數

SRCAA=100(1－CV)(其中CV為RCAA的變異系數，CV=標準差/均數)

EAARR=［1－∑|R－1|/n］×100(R為待測蛋白質中某種氨基酸含量與參考蛋白模式中相對應的必需氨基酸含量的比值，n為待測蛋白質中必需氨基酸的個數)

2 結果

2.1 酵母工程菌粉的感官和理化性狀

凍干制備的ChIFN－γ釀酒酵母工程菌粉色澤呈現淡黃色，具有酵母特殊氣味、無腐敗和異臭味，無異物，外觀為粉狀或者片狀(圖1A)，含水量為5.4%，復水后具有正常酵母細胞形態(tài)和高活細胞率，復水后活細胞數為267.854億個/g，符合GB/T 22547－2008標準中飼用活性干酵母粉的感官要求和酵母活細胞數≥150億個/g及水分含量≤6.0%的理化要求。

2.2 酵母的生長及形態(tài)特性

菌體在液體培養(yǎng)基中緊密沉淀于底部，培養(yǎng)液清亮，無浮膜形成(圖1B);在麥芽固體培養(yǎng)基上，菌落大而濕潤、隆起、乳白色、表面光滑無褶皺、邊緣清晰(圖1C);顯微鏡下觀察到細胞呈卵圓形或者圓形，單個或者成雙，偶爾成簇狀，多邊芽殖(圖1D)。工程菌符合GB/T 22547－2008標準中關于飼用釀酒酵母菌的形態(tài)描述。

圖1 ChIFN－γ釀酒酵母工程菌粉及其復水生長情況Fig.1 The recombinant yeastpowder with ChIFN－γgene and reactivation growth

2.3 工程菌粉中的有毒有害物質含量

ChIFN－γ釀酒酵母工程菌粉中，細菌、霉菌、鉛和總砷含量分別為1.01×104CFU/g、7.1×103個/g、0.41mg/kg 和0.81mg/kg，無沙門氏菌，以上指標檢測結果均顯著低于GB/T 22547－2008標準中對有毒有害物質要求的最低水平(表1)，制備的酵母工程菌粉符合國家標準的衛(wèi)生學要求。

表1 Ch IFN－γ釀酒酵母工程菌粉的衛(wèi)生學檢測Tab.1 The hygienic evaluation of recombinant S.cerevisiae w ith Ch IFN－γgene

2.3 工程菌粉的營養(yǎng)成分

ChIFN－γ重組工程菌粉的灰分、總糖、總磷和總鈣含量分別為 4.88%、16.60%、1.41% 和0.41%，均高于野生型菌粉，其粗脂肪(0.02%)與野生型菌粉接近，但粗蛋白質(30.84%)和粗纖維(0.03%)含量卻顯著低于野生型菌粉(表2)。

工程菌粉中，總必需氨基酸和總非必需氨基酸的含量分別為27.72 mg/g和45.38 mg/g，均高于野生型菌粉。檢測的7種必需氨基酸中，甲硫氨酸、賴氨酸和亮氨酸的含量顯著高于野生型菌粉，但其蘇氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸和纈氨酸4種必需氨基酸的含量則低于野生型菌粉;檢測的9種非必需氨基酸中，組氨酸、精氨酸、尤其是甘氨酸、丙氨酸、酪氨酸和絲氨酸的含量均高于野生型菌粉，而其天門冬氨酸、半胱氨酸和脯氨酸含量則比野生型菌粉低(表3)。

AAS和CS分析表明(表4)，酵母工程菌粉的第一限制性氨基酸為苯丙氨酸+酪氨酸，第二限制性氨基酸為纈氨酸。根據FAO模式和全蛋白模式中 EAAI實用評價標準［14］和其它評定依據［11，17，18］，蛋白質營養(yǎng)評價表明(表4)，ChIFN－γ釀酒酵母工程菌粉的 EAAI(22.22)、SRCAA(22.77)和EAARR(77.41)均較低，表明該菌粉中的必需氨基酸與參考蛋白模式差異性較大，不符合理想蛋白模式要求，不宜直接用作蛋白質飼料。

表2 Ch IFN－γ釀酒酵母工程菌粉的主要營養(yǎng)成分Tab.2 Nutrient content of w ild－type yeast and recombinantS.cerevisiae w ith Ch IFN－γgene

表3 酵母工程菌粉的氨基酸檢測Tab.3 Am ino acid content of w ild－type yeast and recombinant S.cerevisiae w ith Ch IFN－γgene

表4 酵母工程菌粉的蛋白質營養(yǎng)品質分析Tab.4 The protein nutrition and quality analysis of w ild －type yeast and recombinant S.cerevisiae based on the AAS，CS，EAAI，EAARR and SRCAA

3 討論

飼料中的重金屬、病原微生物等有毒有害物質不但影響禽體代謝活動和健康，還會在畜產品中殘留［19］，影響人體健康［20］;如沉積在動物肝、腎、肌肉、乳汁及禽蛋等動物產品中的霉菌毒素可通過食物鏈危害人類健康［21］。本研究中的ChIFN－γ釀酒酵母工程菌粉未檢測到沙門氏菌，其細菌和霉菌數、鉛和總砷含量均符合國家飼料添加劑標準中的衛(wèi)生規(guī)定，若嚴格控制制備工藝和過程，還可進一步提高其安全性。

能量和蛋白質營養(yǎng)對家禽生產具有重要作用［22，23，24］，適量的飼糧代謝能和粗蛋白質水平有利于提高產蛋性能［25］和獲得最佳繁殖性能［26］。ChIFN－γ釀酒酵母工程菌粉的總糖、總磷和總鈣含量較高，可極好的補充日糧能量濃度和礦物質元素，尤其對禽蛋形成極為有利。氨基酸種類和數量決定蛋白質的營養(yǎng)價值［27］，尤其是必需氨基酸的含量和構成比例常常作為評價蛋白質營養(yǎng)價值的根本依據和主要指標。日糧賴氨酸水平與動物生長［28］，［32］、胴體品質［29］、飼料轉化率［30］和提高免疫功能［31］密切相關。工程菌粉的總必需氨基酸和總非必需氨基酸含量較高，尤其是賴氨酸、甲硫氨酸和亮氨酸3種必需氨基酸的含量顯著高于野生型菌粉，但其必需氨基酸之間的差異性較大，粗蛋白質含量較低，這可能和ChIFN－γ工程菌中重組蛋白的表達影響有關。有研究表明，目標產物的誘導表達可嚴重抑制宿主菌的生長，導致其對外界環(huán)境變化的應激力下降［33］。外源蛋白質表達時常常會耗用宿主細胞的大量資源，對宿主造成代謝負荷，引起宿體內的生理生化變化，甚至損害宿主正常的代謝功能［34］。雖然ChIFN－γ釀酒酵母工程菌粉的蛋白模式不屬于理想蛋白，不適合直接作為蛋白質飼料使用，但其含有抗病免疫調節(jié)功能的重組ChIFN－γ，可以保護受病毒感染的雛雞和促進生長(未發(fā)表數據)，并且該菌粉具有較好的安全性，復水活性高，可作為具有作為抗病免疫調節(jié)功能的飼料添加劑進一步開發(fā)應用。

［1］Allen PC.Nitric oxide production during Eimeria tenella infections in chickens［J］.Poultry science.1997;76:810 － 13.

［2］Gabriele L，Ozato K.The role of the interferon regulatory factor(IRF)family in dendritic cell developmentand function.Cytokine＆growth factor reviews.2007;18:503－10.

［3］龔非力.醫(yī)學免疫學［M］.人民衛(wèi)生出版社，2001.

［4］唐香山，張學文.釀酒酵母表達系統［J］.生命科學研究.2004:106－09.

［5］侯文華，李政一，楊 力，等.利用酒糟生產飼料蛋白的菌種選育［J］.環(huán)境科學.1999;1.

［6］陳平潔，陳 莊.飼料酵母在畜禽飼養(yǎng)上的運用及作用機理的探討［J］.廣東畜牧獸醫(yī)科技.1999;24:35－36.

［7］Whitlow L，HaglerW.Mycotoxins in feeds［J］.Feedstuffs.2002;74:68 －78.

［8］Battacone G，Nudda A，Cannas A，et al.Excretion of aflatoxin M1 inmilk of dairy ewes treated with different doses of aflatoxin B1［J］.Journal of dairy science.2003;86:2667 －75.

［9］楊在賓，劉 麗，杜明宏.我國飼料業(yè)的發(fā)展及飼料資源供求現狀淺析［J］.飼料工業(yè).2008;29:45－49.

［10］秦捷敏，宋 莉，盧凌霄.ChIFN－α釀酒酵母工程菌的發(fā)酵條件優(yōu)化［J］.山地農業(yè)生物學報.2014;11:51－54.

［11］顏孫安，林香信，錢愛萍.化學分析法的理想參考蛋白模式及其化學生物價研究［J］.中國農學通報.2010;26:101－07.

［12］Bano Z，Rajarathnam S.Pleurotusmushroom as a nutritious food［J］.TropicalMushrooms Biological Nature and Cultivation Methods P.1982:363－80.

［13］Oser BL.An integrated essential amino acid index for predicting the biological value of proteins［J］.Protein and amino acid nutrition.1959;281.

［14］馮東勛.必需氨基酸指數(EAAI)在飼料中的應用［J］.飼料工業(yè).1997;18:21－22.

［15］朱圣陶，吳 坤.蛋白質營養(yǎng)價值評價——氨基酸比值系數法［J］.營養(yǎng)學報.1988;10:187－90.

［16］趙建幸.蛋白質營養(yǎng)評價新方法的研究——必需氨基酸相對比值法［J］.食品工業(yè).1991;5:38－40.

［17］滕 瑜，李 娟，郭曉華，等.大菱鲆裙邊的營養(yǎng)分析及評價［J］.現代食品科技.2013;29:1110－11.

［18］蒲正宇，史軍義，姚 俊，等.箭環(huán)蝶營養(yǎng)成分分析［J］.中國農學通報.2014;30:307－10.

［19］Kan C，Meijer G.The risk of contamination of food with toxic substances present in animal feed［J］.Animal feed science and technology.2007;133:84－108.

［20］劉美江.飼料中的重金屬污染對家禽的危害［J］.山東畜牧獸醫(yī).2011;32:53－54.

［21］Robens J，Richard J.Aflatoxins in animal and human health［J］.Reviews of environmental contamination and toxicology:Springer，1992;69－94.

［22］Choct M.家禽飼料能量營養(yǎng)價值的評定系統［J］.中國家禽.2013;12:015.

［23］高 慶，張克英.飼料營養(yǎng)成分對雞蛋品質的影響［J］.中國飼料.2004:22－25.

［24］劉 偉，劉盛南，李俊營.不同營養(yǎng)水平日糧對蛋用鵪鶉產蛋性能及血清生化指標的影響［J］.安徽農業(yè)科學.2014:8617－18.

［25］夏偉光，張罕星，林映才，等.飼糧代謝能和粗蛋白質水平對蛋鴨產蛋性能的影響［J］.動物營養(yǎng)學報.2014;26:3599－607.

［26］朱 翠，蔣宗勇，蔣守群，等.日糧代謝能和蛋白質水平對30—39周齡嶺南黃羽肉種雞繁殖性能的影響［J］.中國農業(yè)科學.2012;1:020.

［27］Datta AK.Handbook ofmicrowave technology for food application［M］.CRC Press，2001.

［28］任建民，劉 強.賴氨酸營養(yǎng)研究進展［J］.飼料博覽.2009;3:13－15.

［29］劉升軍，咼于明.日糧蛋氨酸及賴氨酸水平對雌性肉仔雞胴體組成的影響［J］.中國畜牧雜志.2001;37:5－8.

［30］Han Y，Baker Dh.Digestible lysine requirementofmale and female broiler chicks during the period three to six weeks posthatching［J］.Poultry science.1994;73:1739 － 45.

［31］王洪榮，季 昀.氨基酸的生物活性及其營養(yǎng)調控功能的研究進展［J］.動物營養(yǎng)學報.2013;25:447－57.

［32］王 彬，李 奇.亮氨酸的代謝及營養(yǎng)生理作用研究進展［J］.飼料研究.2012:14－16.

［33］陳 燏，朱善良.PET質粒表達對宿主菌的影響研究［J］.江蘇教育學院學報(自然科學版).2011:30－34+92.

［34］鄭志永，關怡新，林東強，等.重組基因表達對大腸桿菌生理的影響［J］.生物加工過程.2004;2:13－17.