硫氰酸鉀法在出口烤煙煙堿檢測中的適用性研究

蔡 斌，黃維棣*，左聞宇，曾小偉，高煥曄

(1.貴州煙葉復烤有限責任公司，貴州 貴陽 550005;2.貴州大學貴州省煙草品質研究重點實驗室，貴州 貴陽 550025)

煙草行業中的植物堿指的是煙草及煙草制品中全部生物堿的總稱，主要有煙堿、降煙堿、新煙草堿和假木賊堿等［1－2］，其中以煙堿(既尼古丁)含量最高，達到94%以上［3］。在煙葉含有的很多化合物中，煙堿是最有影響的成分，它與嗅覺一結合就產生刺激作用(煙堿通過肺的吸收到達腦部的時間只有7秒鐘)，同時形成一種使人愉悅、滿足和依賴感的絡合物［4］。將煙堿相關化合物作為香料來利用也是近幾年來新出現的動向［5］。因此植物堿尤其是煙堿作為煙草及煙草制品中重要的檢測指標越來越受到加工企業以及客戶的重視。

長期以來，對國際客戶煙堿的分析按照Y/CT 160－2002《煙草及煙草制品總植物堿的測定連續流動法》［6］進行檢測。這種方法雖然檢測的結果穩定，但是存在重大安全隱患和局限性:實驗需要的氰化鉀屬于劇毒物質，使用劇毒物質不但需要擁有專業知識的人員進行操作，對操作人員造成了潛在的使用危險，對企業來說是重大危險源;國家和地方對氰化鉀的購買、使用、保管、廢液的處理都有非常嚴格的規定［7］。隨著我國安全管理的規范性提高，相應制度越來越嚴格，氰化鉀的使用將會受到更加嚴格的限制。2009年，CORESTA常規分析化學分組審議了一個更安全的煙堿測定方法，該方法用NaOCl和KSCN反應產生CNCl。處理硫氰酸鉀時，無需特殊的預防措施。2010年經過實驗室間對比測試，結果令人滿意［8］。2010年，Mehta等［9］提出了一種改進的步驟，用二氯異氰尿酸(DCIC)替代NaOCl，其優點是提供了一種比NaOCl更加穩定的氯源。2011年，CORESTA化學常規分析組研究了這種方法，發現雖然其靈敏度小于等于50%，但依然能夠滿足數據分析的要求。2013年2月28日，國家煙草專賣局頒布了YC/T 468－2013《煙草及煙草制品 總植物堿的測定 連續流動(硫氰酸鉀)法》［10］，規定了試劑制備、設備要求、實驗室條件等一系列指標。

貴州打葉復烤企業的國際客戶一般要求多等級多部位配方混打，且等級跨度比較大，結構比較復雜，因此對煙草制品化學成分，尤其是煙堿檢測準確度要求較高;同時，國際客戶還要求每周用客戶提供的標準樣品測試結果對設備分析數據的準確性進行驗證，而近紅外光譜分析達不到其準確度的要求。針對貴陽復烤廠長期加工出口烤煙過程中，國際客戶對于植物堿數據檢測的準確性要求較高的特點，本實驗采用硫氰酸鉀法和氰化鉀法進行比對測試，并與客戶提供的數據進行比對，驗證硫氰酸鉀法對于出口烤煙煙堿檢測中的實用性及準確性，促進國際客戶對此方法的認可。

1 材料與方法

1.1 材料、設備與試劑

供試樣品:客戶提供出口烤煙原煙樣品和配方打葉成品片煙樣品，貴陽復烤廠加工配方打葉成品片煙樣品，所有樣品均粉碎過1mm篩。

設備:德國SEAL牌連續流動分析儀全套，包括分光光度計(配460 nm濾光片)和三維進樣器;電子稱(型號AB104為梅特勒·托利多、感量0.1 mg);調速多用振蕩器(上海雙捷實驗設備有限公司、HY －8)。

試劑:二氯異氰尿酸鈉(C3Cl2N3NaO3)(阿法埃莎(天津)化學有限公司、純度＞97%)，硫氰酸鉀(KSCN)、無水對氨基苯磺酸(NH2C6H4SO3H)(天津市科密歐化學試劑有限公司、分析純)十二水磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)(西隴化工股份有限公司、分析純)檸檬酸［COH(COOH)(CH2COOH)2·H2O］(重慶川東化工(集團)有限公司、分析純)冰乙酸(CH3COOH)(重慶市東方試劑研究所、分析純)brij－35(聚乙氧基月桂醚、北京拜爾迪生物公司)，尼古丁(C5NH4－C4H7NCH3、英國BDH實驗室)，烤煙標準樣(國家煙草總公司青州煙草研究所)。

1.2 試驗方法

1.2.1 實驗設計 試驗分為3組，前2組分別使用氰化鉀法和硫氰酸鉀法，在同樣的試驗條件下進行測試。第1組為客戶提供出口烤煙原煙樣品，每個樣品測試3次，使用3次平均數。第2組為配方打葉成品等級，進行3次平行試驗，每次試驗隨機抽取不同配方成品片煙等級3個，每個等級隨機抽取3個不同號段的來自每100箱成品的混合樣，共27個樣品，每個樣品測試1次。第3組為客戶提供樣品，每個樣品使用硫氰酸鉀法進行測試3次，使用3次平均數，同時此樣品在不同國家實驗室用氰化鉀法進行測試。

1.2.2 試劑配制 (1)硫氰酸鉀法試驗試劑配置按照YCT468－2013要求進行配制［10］。

緩沖溶液A:

稱取65.5 g磷酸氫二鈉、10.4 g檸檬酸至燒杯中，用水溶解，然后轉入1000mL容量瓶中，用水定容至刻度，加入1mL brij 35溶液，混勻。使用前用定性濾紙過濾;

緩沖溶液B:

稱取222 g磷酸氫二鈉、8.4 g檸檬酸、7.0 g對氨基苯磺酸至燒杯中，用水溶解后轉入1000mL容量瓶中，加用水定容至刻度，加入1mL Brij 35溶液混勻。使用前用定性濾紙過濾;

硫氰酸鉀溶液:

稱取2.88 g硫氰酸鉀至燒杯中，用水溶解后轉入250mL容量瓶中，用水定容至刻度。

二氯異氰尿酸鈉溶液:

稱取2.20 g二氯異氰尿酸鈉至燒杯中，用水溶解，然后轉入250 mL容量瓶中，用水定容至刻度。該溶液現配現用。

(2)氰化鉀法試驗試劑配制按照Y/CT 160－2002 要求進行配制［6］。

1.2.3 系列標準工作溶液制作 標準溶液濃度范圍應覆蓋預計檢測到的5個標準樣的樣品含量，其尼古丁濃度分別為6.25%、5.00%、3.75%、2.5%、1.25%。配制方法如下:1.首先配置尼古丁儲備液:精確稱取1.923 g純尼古丁固體，在用5%醋酸溶液在燒杯中溶解后移入1000mL容量瓶，定容至刻度;2.準備5個100mL的容量瓶，分別標注1到5號;按照順序，用移液器分別轉移50 mL、40 mL、30mL、20 mL、10 mL尼古丁儲備液，再分別用5%醋酸定容至刻度［11］。

1.2.4 試驗樣品萃取液制作 將樣品準確稱取0.2 g(精確到小數點后3位)，加入三角瓶中，用移液器量取20mL 5%冰乙酸，在室溫(23攝氏度)下震蕩30min。并同時制作標準對照樣:用已知尼古丁含量的青州煙樣作為對照標準，青州標準樣萃取液的制作方法與樣品萃取液的制作方法相同。

1.2.5 分析條件 比色計波長:460 nm;進樣時間:90 s;樣品清洗時間:60 s;加熱槽溫度:37℃

使用流動分析管路如下:

圖1 流動分析管路示意圖Fig.1 Diagram of flowing analysis pathway

1.3 數據統計與分析

統計軟件為DPS7.05數據處理系統，將本研究中氰化鉀法和硫氰酸鉀法兩種方法測定的樣品煙堿含量視為兩組樣本，兩組數據以組平均數進行相互比較，來檢驗其差異顯著性，判斷兩種方法在煙堿測定結果上的差異是否顯著。兩處理方差齊性檢驗用F檢驗，兩處理均值差異檢驗用成組設計t檢驗法。

2 結果

2.1 原煙樣品使用兩種不同方法進行比對測試

對客戶提供的原煙樣品使用兩種不同方法進行測試，檢測結果見表1，統計分析結果見表2。其兩處理方差齊性均值差異檢驗p=0.9473，大于0.05，表明兩種測試方法無顯著性差異。

表1 原煙兩種不同測試法對比Tab.1 Comparison of two detection methodswith raw tobacco

表2 原煙兩種檢測方法數據分析Tab.2 Data analysis of two detection methodswith raw tobacco

2.2 配方打葉成品等級使用兩種不同方法進行比對測試

對配方打葉成品等級使用兩種不同方法進行測試，檢測結果見表3，統計分析結果見表4。上部煙兩處理方差齊性均值差異檢驗p=0.9979，中部煙兩處理方差齊性均值差異檢驗p=0.7195，下部煙兩處理方差齊性均值差異檢驗p=0.7268，均大于0.05，表明兩種測試方法對于不同部位煙葉的檢測無顯著性差異。

表3 配方煙葉兩種不同測試法對比Tab.3 Comparison of two testmethodswith threshed strips

2.3 同一樣品在不同國家實驗室用兩種不同方法比對測試

將硫氰酸鉀法測定結果與約旦和德國實驗室采用氰化鉀法測定的結果進行對比(表5)，三個實驗室測試結果的相對偏差都在2%以內，表明硫氰酸鉀法與不同國家實驗室測試結果的一致性較好。

3 討論與結論

本試驗采用硫氰酸鉀法和氰化鉀法，分別對出口烤煙的原煙和配方打葉成品片煙進行煙堿比對檢測。檢測結果表明，在對原煙與成品片煙配方的檢測中，兩種方法沒有顯著性差異。通過將硫氰酸鉀法測定結果與不同國家實驗室采用氰化鉀法檢測的結果進行比對，其測試結果的相對偏差都在可接受范圍(2%)以內。表明硫氰酸鉀法在出口烤煙的檢測中能夠達到檢測復雜配方成品片煙的出口準確度要求，檢測結果符合國際客戶的要求。硫氰酸鉀法與氰化鉀法相比更加安全可靠，可以取代氰化鉀法，作為貴州省出口烤煙煙堿的測定方法。

表4 成品片煙兩種方法數據分析Tab.4 Data analysis of two detection methods with refined tobacco

表5 同一樣品在不同國家實驗室測試對比Tab.5 The comparison of same sample using different test methods in different state key laboratories

本試驗在配置緩沖液B時，因硫酸二氫鈉25℃時的溶解度為77 g/L，配置溶液時配置的量為222 g/L，加熱溶解后，容易在恢復實驗室溫度(20℃ －25℃)時析出晶體。實驗前需用快速濾紙進行過濾。溶質的減少是否對試驗結果有影響，還需要試驗進行驗證。

［1］王瑞新，煙草化學［M］.北京:中國農業出版社，2003.

［2］史宏志，張建勛.煙草生物堿［M］.北京:中國農業出版社，2004.

［3］史宏志，Bush L P，Wan J，等.中國不同類型煙葉煙堿向降煙堿轉化研究［J］.中國煙草科學，2001，7(4):6－8.

［4］周正紅，高孔榮，張水華，等.煙草中化學成分對卷煙色香味品質的影響及其研究進展［J］.煙草科技，1997(2):22－25.

［5］H.Matsushita et al.Nornicotine derivatives as tobacco flavorants［P］.Japan，Japan Kokai Patent，J801976.

［6］YC/T 160－2002煙草及煙草制品 總植物堿的測定連續流動法［S］.

［7］中華人民共和國國務院令第344號(2002年1月26日公布，2013年12月7日修訂).《危險化學品安全管理條例》.

［8］中國煙草學會網站，2012年 CORESTA大會論文文摘，http://www.tobacco.org.cn/html/14/1403/140335/43649_n.html，2013－10－12.

［9］Mehta SK，Rajesh B J，Dhalewadikar SV.Determination of total alkaloids as nicotine in tobacco by continuous flow analyzer using stable and safer reagents［采用穩定、安全的試劑和連續流動分析儀測定煙草中的總植物堿(以煙堿計)］［C］.CORESTA Congress，Edinburgh，2010，Smoke Science/Product Technology Groups，abstr SSPT19.

［10］YC/T 468－2013煙草及煙草制品 總植物堿的測定 連續流動(硫氰酸鉀)法［S］.

［11］李智勇，主編.貴州省煙草商業打葉復烤企業基礎標準和技術標準［M］.貴陽:2009.