斑馬魚對水源特定污染物的水質監測預警

馬中雨，陳家全，陳興廳，宋武昌，逯南南，孫韶華，賈瑞寶

山東省城市供排水水質監測中心，山東 濟南 250021

生物監測預警是一種利用魚類、發光菌、水蚤等受試生物作為生物傳感器監測水質變化、判斷其是否受到污染并對污染程度進行評價的方法。魚類對水環境的變化非常敏感，在外部環境壓力下，魚類的行為會發生相應的變化，所以，通過監測魚類的行為變化可以實現水質污染事件的在線報警。目前，魚類行為生態學是國內外科研工作者研究的焦點之一［1-5］，國內外已經有多種生物魚在線監測預警系統應用于水質在線監測［6-9］，但是斑馬魚在水質生物預警系統中的應用研究報道較少。該研究以斑馬魚為受試生物，利用水質在線生物安全預警系統分析斑馬魚在6種環境污染物下的行為變化及系統報警特征，為飲用水水源突發水污染的生物監測預警提供參考。

1 實驗部分

1.1 監測系統

在斑馬魚行為在線監測中，采用水質安全在線生物預警系統(BEWs-3，中國科學院生態研究中心研制，示意圖見圖1)進行。該系統主要由生物傳感器、信號采集處理系統、信號分析評估系統及顯示器組成。其預警原理是在一定環境壓力下，生物行為反應是外界環境和內部生理變化的外在體現，所以生物行為變化可以起到環境變化警示作用，通過生物行為監測系統在線監測斑馬魚在水體污染情況下行為強度變化，達到監測被測水體污染狀況的目的。在斑馬魚行為監測過程中，采用直徑為5 cm、長7 cm的圓柱形生物傳感器。

圖1 水質安全在線生物預警系統示意圖

1.2 受試生物

斑馬魚(Zebrafish)，屬真骨魚總目、鯉科，是一種敏感的水生模式生物，其生物學背景研究充分，對多種有毒化學物質或環境污染物敏感，被國際標準化組織列為毒性實驗受試種之一，國內外被廣泛應用于多種有毒化學物質的生態風險評估。因此，選擇斑馬魚為生物傳感器開展研究工作。選擇的斑馬魚長(30±5)mm、重(0.3 ±0.1)g。

1.3 實驗設計

采用動態水流監測斑馬魚的行為反應。在污染物暴露實驗中，針對黃河下游地區引黃供水系統水源濁度高、同時面臨有機物和重金屬污染風險的情況，選擇濁度、亞硝酸鹽氮、石油類、苯、砷化物、錳等6個指標，分別測試其對斑馬魚的行為毒性。實驗過程中，為了明確生物綜合行為的變化，采用生物綜合行為強度(Behavior Strength)來反映其行為變化，在此過程中，判斷生物行為強度發生劇烈變化的標準:變化以前連續5次行為強度平均值與變化以后連續5次行為強度平均值差異達到20%以上。

在受試生物動態實驗過程中，實驗開始每個通道保持2條體長2.5～3 cm的受試魚，直至實驗結束。實驗過程中不喂食，并控制每個通道水流量為2 L/h。

實驗過程中生物暴露的污染物濃度參考《地表水環境質量標準》(GB 3838—2002)III類水體中限值以及生物監測方法的靈敏度2個因素，除濁度和苯外，其他指標均選擇標準濃度的5倍和10倍，濃度設置見表1。

采用地表水加標方式調整實驗濃度，加標物質及其參數如表2所示。在不同濃度污染物暴露過程中采用6組平行，監測周期24 h，并通過平均值反映斑馬魚的行為反應，在此基礎上評價斑馬魚的敏感性。

表1 實驗中各污染物濃度設置

表2 加標物質及其參數

2 結果與分析

2.1 斑馬魚在不同污染物下的行為變化

利用水質安全在線生物預警系統分別測定了斑馬魚在濁度、石油類、亞硝酸鹽氮、砷、錳、苯6個指標下的行為強度變化，實驗結果見圖2～圖7，圖中各對照均為純水。

由圖2可以看出:在濁度為10.1 NTU時，斑馬魚行為強度沒有受到顯著的影響;而當濁度為53.8 NTU時，斑馬魚在暴露11 h后行為強度開始緩慢下降，2 h后行為強度降到最低，下降幅度為13.7%，其后行為強度緩慢恢復。總體上看，濁度為10、53.8 NTU的水溶液對斑馬魚行為強度的影響不顯著。

當斑馬魚在石油類質量濃度為0.25 mg/L的水體中暴露時，10 h后行為強度開始緩慢下降;暴露21 h后，行為強度恢復到初始狀態，未出現報警信息;而在石油類質量濃度為0.5 mg/L的水體中暴露時，4 h后行為強度開始下降，22 h后行為強度恢復到開始狀態，也未出現報警信息，見圖3。可見，石油類對斑馬魚行為強度的影響有一定的劑量效應。

圖2 斑馬魚在不同濁度下行為變化情況

圖3 斑馬魚在不同濃度石油類條件下行為變化情況

圖4 斑馬魚在不同濃度亞硝酸鹽氮條件濁度下行為變化情況

圖5 斑馬魚在不同濃度錳條件下行為變化情況

圖6 斑馬魚在不同濃度砷條件下行為變化情況

圖7 斑馬魚在不同濃度苯條件下行為變化情況

由圖4可知，斑馬魚在亞硝酸鹽氮質量濃度為5 mg/L的溶液中暴露24 h后，沒有明顯差異，未出現報警;而在濃度質量達到10 mg/L時暴露10 h后即出現報警。

斑馬魚分別暴露在質量濃度為0.5 mg/L和1 mg/L的錳溶液中時，分別暴露1 h和1.5 h后即出現報警，除對照外其余通道魚全部死亡，結果見圖5。這說明生物魚系統對重金屬錳的靈敏性較好，反應敏感。

由圖6可見，斑馬魚在砷質量濃度為0.25 mg/L的溶液中暴露1 h后行為強度開始緩慢下降，7 h后斑馬魚行為強度降到0.2以下，全部死亡，0.5 h后即出現報警。在砷質量濃度為0.5 mg/L時暴露10 min后行為強度開始下降，1.2 h后行為強度下降到0.2以下，除對照外均死亡，1.7 h后出現報警。可見，斑馬魚對砷反應的劑量效應非常明顯。

由圖7可見，斑馬魚在質量濃度為0.25、0.5 mg/L苯溶液中暴露時，均有報警，報警時間分別是實驗開始后14.25和3 h，2種濃度下均全部死亡;隨著苯濃度的提高，對其行為的影響也顯著增強。這說明苯對斑馬魚具有較高的毒性。

在24 h暴露過程中，對照組內斑馬魚行為未隨時間的變化而發生行為強度的明顯升高或降低，同時，實驗結果表明:在同一污染物暴露下，生物行為強度隨暴露時間變化而變化，也會隨暴露濃度的變化而變化。在濁度、石油類、亞硝酸鹽氮、苯、砷、錳等高濃度的污染水體暴露下，斑馬魚的行為強度都有所下降，下降幅度分別為13.7%、37.7%、35.4%、62.1%、90%、95%，而在較低濃度的污染水體中，斑馬魚行為強度下降幅度分別為0、18.6%、0、10.2%、90%、95%，結果見表 3。

表3 斑馬魚在各污染物暴露下的行為強度變化分析

由表3可見，不同的污染物及其濃度對斑馬魚的行為強度產生了不同的影響，反映了不同污染物對斑馬魚毒性作用的不同，而這也為利用水質安全在線生物預警系統監測水質變化、判斷水質污染物的類型提供了線索。

2.2 在線生物預警系統報警特征與斑馬魚行為變化之間的關系

在水質安全在線生物預警系統中，生物魚是整個系統的生物傳感器，其作用是感知水質變化，并通過行為上的變化來反映水質的變化。生物魚行為變化的極端情況是在污染物毒性作用下失去行為能力甚至死亡。在實驗中，生物魚的死亡率與預警系統的報警結果見表4。

由表4可以看出，不同污染物對斑馬魚的毒性作用存在較大差異。在濁度、石油類的低濃度和高濃度溶液中，受試生物魚死亡率均為0;在亞硝酸鈉氮、苯的低濃度溶液中，受試生物魚未見死亡，在高濃度溶液中，均有死亡;在砷和錳的高、低濃度溶液中，受試生物魚死亡率為100%。這一結果與生物魚行為強度的變化相吻合。生物預警系統出現報警的情況與生物魚死亡的情況具有很好的相關性。生物預警系統不僅能夠在受試生物魚全部死亡時報警，而且在生物魚因為毒性物質的作用出現部分死亡時也能夠報警，而在沒有生物魚死亡的情況下無報警。另外，對于不同類型的污染物，儀器出現報警的反應時間也不同。例如:在0.5 mg/L亞硝酸鈉氮溶液中，暴露10 h后儀器發出報警;而在0.5 mg/L錳溶液中，暴露1 h后即發出報警。這一結果也與生物魚行為強度變化相吻合。

表4 不同污染狀況下斑馬魚行為變化及在線報警特征

3 討論

在線生物監測技術通過生物傳感器監測水體內受試水生生物不同水平上的生物學指標變化，預警水質的變化，實現對環境的在線監測，實時對水環境污染與否、污染的嚴重性做出在線評價。該技術已經在多個國家應用于水體突發性污染事故的在線預警［10-13］。在線生物監測技術的核心是通過生物傳感器監測到在環境污染物壓力下的各種生物信號，經過處理器處理以后，再由計算機將處理后的數字信息以可視信號顯示出來，達到在線生物監測的目的。大量的研究表明［14-16］，生物的行為生態學變化與環境污染物壓力存在顯著的相關性。本研究結果表明:生物魚的行為生態學變化與環境壓力大小直接相關，在高濃度污染物的環境內，生物魚的行為生態學出現劇烈變化;生物魚的行為生態學變化與在一定壓力環境內的暴露時間直接相關，隨著暴露時間的增長，生物魚的行為生態學變化會逐漸降低;生物魚的行為生態學變化隨環境壓力的變化而不同。

不同地區的地表水水質具有不同的特征性污染物，如濟南的引黃水庫水具有高藻、高有機物的水質特征［17］。根據本研究結果，按照斑馬魚行為強度及報警時間，可以將濁度、石油、亞硝酸鹽、苯、砷、錳劃分為3類指標:濁度和石油，這2個指標對斑馬魚行為強度影響較小，生物魚未出現死亡和報警情況;亞硝酸鹽氮和苯，這2個指標對斑馬魚的行為強度影響居中，都只在高濃度下報警;砷和錳，這2個指標對生物魚行為強度影響最顯著，報警時間也較短。所以，在利用在線監測技術監測水源水質時，要結合當地的水質特征開展研究，對設備預警參數進行優化，設定更加符合水質特征的報警閾值。

另外，斑馬魚是熱帶魚種，存在對環境適應性的問題，應該加強研究，開發適合當地的魚種，應用于水質安全預警。

4 結論

斑馬魚的行為生態學變化與環境污染物壓力存在顯著的相關性。斑馬魚的行為生態學變化與環境壓力大小直接相關，在高濃度污染物的環境內，斑馬魚的行為生態學出現劇烈變化;斑馬魚的行為生態學變化與在一定壓力環境內的暴露時間直接相關，隨著暴露時間的增長，斑馬魚的行為生態學變化會逐漸降低;斑馬魚的行為生態學變化隨環境壓力的變化而不同;水質在線生物安全預警系統對不同類型污染物的反應靈敏度不同，應結合當地的水質特征設定報警閾值。

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