當歸多糖對血管型癡呆低糖低氧PC12細胞凋亡的影響

鄧健男，曾靜玲，李海龍，楊植媛，楊長生

(1.武漢市中醫醫院，湖北 武漢430100；2.甘肅中醫學院，甘肅 蘭州730000)

?

當歸多糖對血管型癡呆低糖低氧PC12細胞凋亡的影響

鄧健男1，曾靜玲1，李海龍2，楊植媛2，楊長生2

(1.武漢市中醫醫院，湖北 武漢430100；2.甘肅中醫學院，甘肅 蘭州730000)

目的：觀察當歸多糖 (Angelica Sinensis Polysaccharide ride，ASP ) 對低亞硫酸鈉誘導的低糖低氧PC12細胞模型的影響，探討當歸多糖影響細胞凋亡的作用機制。方法：將體外培養的大鼠腎上腺嗜鉻腫瘤細胞(PCl2細胞)分為空白對照組、OGD(oxygen-glucose deprivation)模型組、當歸多糖組，采用MTT法檢測各組細胞存活率，采用比色法檢測LDH、T-SOD、MDA酶學指標，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡率，采用RT-PCR檢測Bax和Bcl-2表達情況。結果：缺糖缺氧損傷組細胞存活率均顯著低于空白對照組(P<0.05)，各劑量當歸多糖組細胞存活率均高于損傷組，且200μg·L-1濃度的當歸多糖組細胞存活率最高，差異均具有統計學意義(P<0.05)。結論：當歸多糖可提高LDH、T-SOD活性，降低MDA含量，有效降低細胞凋亡率，可不同程度地保護PC12細胞。

當歸多糖；血管型癡呆；細胞凋亡

細胞缺糖缺氧(Oxygen-Glucosedeprivation，OGD)損傷多見于腦缺血、心肌缺血等缺血性損傷疾病。ODG是血管性癡呆(Vascular dementia，VD)的典型癥狀，其發生發展與神經細胞所處的OGD環境有密切關系。壞死和凋亡是缺血性神經細胞損傷的兩種主要形式。當歸作為中醫圣藥，含有阿魏酸、藁本內酯、當歸多糖等多種成分，對免疫系統、循環系統、呼吸系統、血液系統等均有一定的藥理作用[1-2]。筆者選擇當歸多糖進行研究，嘗試從酶學角度揭開當歸治療VD的機制。

1 材料與儀器

PC-12細胞(上海中科院生物研究所)；LDH、T-SOD、MDA試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：20110928)；新生小牛血清(Gibco公司)；DMEM培養基(Sigma公司，批號：20120430)；低亞硫酸鈉(天津精細化工有限公司，批號：20120405)；Benchmark plus連續波長酶標儀(上海新振儀器設備有限公司)；倒置顯微鏡(日本奧林巴斯光學株式會社，型號：IX71)；COULTER EPICS XL流式細胞儀(美國beckman公司)；CFX-96實時反應系統(美國博樂公司)。

2 方法

2.1 VD細胞模型制備和分組

參考石瑞麗等[3-4]方法稍加改進建立OGD模型，在CO2培養箱(37℃，5%CO2)中，采用含15%新生小牛血清的DMEM培養液培養PC12細胞，2～3天傳代1次，取對數生長期細胞進行實驗。將正常DMEM培養液(含15%的新生小牛血清)培養的PC12細胞作為正常對照組；在5%CO2、37℃培養箱中，將各組缺糖缺氧1、4、12h的PC12細胞模型組分別用含20mmol·L-1與40mmol·L-1低亞硫酸鈉的無糖PBS液培養相應時間后作為模型組，測定相關指標。

2.2 四氮唑藍比色法(MTT法)檢測細胞活力

采用 MTT 法檢測造模后PC12細胞的活力變化，待PC12細胞生長至對數生長期時，采用DMEM培養基將細胞濃度調至3×105個·mL-1。將上述各組細胞懸液分別以100μL/孔的計量滴入96孔培養板，設置正常細胞對照孔和調零孔，向調零孔中加入100μL DMEM完全培養基，向對照組孔中加入100μL細胞懸液。實驗處理后各組每孔加入MTT 10μL，37℃孵育4h后移棄培養液，每孔加入150μL DMSO，振蕩10min，使結晶物充分溶解。在570nm波長下，采用酶聯免疫檢測儀測定各孔光吸收值(OD值)，記錄結果。

2.3 生化法檢測細胞培養上清液LDH、MDA和SOD含量

經損傷處理后，收集細胞上清液，參照試劑盒說明書，采用比色法于紫外可見分光光度計上檢測上清液中LDH、MDA和SOD活性。

2.4 流式細胞術檢測凋亡情況

采用Annexin V-FITC和PI雙染流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，調整細胞計數為1×106個·mL-1，接種于T-50培養瓶中，參照試劑盒說明書進行檢測，記錄激發光波長為475nm處的熒光強度。

2.5 統計學方法

3 結果

3.1 細胞活力檢測

采用MTT法檢測細胞活力發現，與空白對照組比較，40mmol·L-1低亞硫酸鈉1h模型組細胞存活率顯著降低，差異具有統計學意義(P<0.05)，但隨著時間的延長，細胞存活率又有所回升，可能與造模劑的逐漸消耗有關；與模型組比較，各給藥組細胞存活率均顯著升高，差異具有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 當歸多糖對不同濃度低亞硫酸鈉造模各組細胞存活率的影響 ±s,n=6)

注：與對照組比較，*P<0.05;與模型組比較，#P<0.05。

3.2 酶學指標檢測

與模型組比較，各組細胞溶液MDA含量均顯著降低，T-SOD酶、LDH酶活性顯著增強，差異具有統計學意義(P<0.05)。與空白對照組比較，40mmol·L-1低亞硫酸鈉模型組細胞MDA含量顯著升高，T-SOD酶、LDH酶活性顯著下降，組間比較差異具有統計學意義(P<0.05)。不同濃度的當歸多糖作用于PC12細胞后，與模型組比較，200μg·L-1當歸多糖組細胞MDA含量顯著降低，T-SOD酶、LDH酶活性顯著增強，差異具有統計學意義(P<0.05)。見表2。

3.3 細胞凋亡率檢測

各劑量當歸多糖組細胞存活率均高于損傷組，且200μg·L-1濃度當歸多糖組細胞存活率最高，差異均具有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

組別LDH活力(U·mL-1)T-SOD活力(U·mL-1)MDA含量(nmol·mL-1)空白組68.39±5.131.45±0.073.31±0.4340mmol·L-1低亞硫酸鈉組46.43±4.13*1.24±0.06*7.10±0.27*25μg·L-1組48.72±4.47#1.30±0.06#6.06±0.31#50μg·L-1組52.49±5.12#1.32±0.05#4.60±0.44#100μg·L-1組56.81±4.47#1.34±0.06#3.63±0.56#200μg·L-1組56.76±7.23#1.32±0.04#4.35±0.41#

注：與對照組比較，*P<0.05;與模型組比較，#P<0.05。

圖1 各濃度當歸多糖對細胞凋亡率影響

3.4 RT-PCR檢測Bax和Bcl-2的表達情況

隨著劑量的增加，當歸多糖給藥組細胞Bax表達量逐漸降低，Bcl-2表達量逐漸升高，與空白組比較差異均具有統計學意義(P<0.05)。見表3。

組別BaxBcl-2空白組0.85±0.031.05±0.0640mmol·L-1低亞硫酸鈉造模組1.00±0.001.00±0.0025μg·L-1當歸多糖組1.52±0.06△1.54±0.13△50μg·L-1當歸多糖組1.39±0.05△2.16±0.23△100μg·L-1當歸多糖組1.02±0.03△3.29±0.34△200μg·L-1當歸多糖組0.93±0.02△7.07±0.47△

注：與空白組比較，△P<0.05。

4 討論

腦缺血導致的神經元死亡類型包括壞死、凋亡和自噬三種[5]，由于凋亡和自噬延遲發生，使其成為藥物治療的靶點，但自噬在其中的作用還存在爭議[6]。繆春明等[7]通過對PC12細胞OGD損傷過程的研究發現，自噬和凋亡在細胞OGD損傷過程的早期和晚期分別占有主導地位。凋亡蛋白表達引起細胞死亡，凋亡造成的神經細胞大量丟失可能是VD發生的原因[8]。Bcl-2家族基因的表達和調控對細胞的凋亡有著至關重要的作用，其可通過多種通路參與細胞凋亡信號轉導。Bax和Bcl-2是Bcl-2家族中最有代表性的促進凋亡和抑制凋亡的基因，其中Bax作為Bcl-2活性的主要調控因子，參與細胞凋亡進程[9]。

采用一定濃度的連二亞硫酸鈉與培養液中的低濃度O2反應模擬缺氧環境，通過無糖PBS緩沖液模擬缺糖環境，可有效避免頻繁開合培養箱導致的造模環境不穩的弊端，更方便有效地模擬ODG模型[3-4]。

最新研究表明，當歸提取物以及當歸組成的復方補陽還五湯對血管性癡呆患者的行為學和海馬神經元形態學等有較好的改善作用。大量文獻提示當歸相關制劑對心血管疾病患者血管內皮細胞、神經細胞等組織的Bax和Bcl-2表達有明顯調節作用，提示當歸有效成分對血管性癡呆具有潛在的治療作用[10-13]。本研究結果表明當歸多糖能顯著提高體外培養PC12的T-SOD、LDH的生物活性，降低MDA含量，降低細胞凋亡率，這也表明當歸多糖能有效提高PC12的抗凋亡能力，可能與其調節Bcl-2/Bax的表達有關。

[1] RICE JE,VANNUCCIRC,BRIERLEY JB.Theinfluence of immaturity on hypoxic-ischemic Brain damage in the rat[J].Ann Neurol,1981,9(2):131-141.

[2] 劉醫輝,楊世英,馬偉林,等.當歸藥理作用的研究進展[J].中國當代醫藥,2014,21(22):192-196.

[3] 石瑞麗,胡金鳳,孔令雷,等.瓜子金皂苷己對連二亞硫酸鈉致氧糖剝奪/復供誘導PC12細胞凋亡的抑制作用[J].中國藥理學通報,2013,29(3):333-336.

[4] 許蜀閩,王培勇,馬紅英.連二亞硫酸鈉在建立培養細胞的無氧環境中的應用[J].第三軍醫大學學報,2005,27(4):359-360.

[5] LIPTON P.Ichemic cell death in brain neurons[J].Physiol Rev,1999(79):1431-1568.

[6] RAMIA,KGEL D.Apoptosis meets autophagy-like cell death in the ische-micpenumbra:two sides of the game coin[J].Autophagy,2008,4(4):422-426.

[7] 繆春明,張勇,王偉偉,等.自噬及凋亡相關蛋白在PC12細胞缺糖缺氧過程中的表達及其意義[J].中國老年學雜志,2010,30(1):78-80.

[8] 羅永豎,藺心敬,李呂力,等.血管性癡呆模型大鼠海馬神經元凋亡和病理改變的實驗研究[J].中國老年學雜志,2008,28(18):1788-1789.

[9] ROSSE T,OLIVIER R,MONNEY L,et al.Bcl-2 prolongs cell survival after Bax-induced release of cytochrome[J].Nature,1998,391(6666):496-499.

[10] 楊靜薇,田峻,鄒凡,等.當歸對大鼠局灶性缺血腦組織細胞凋亡的作用[J].武漢大學學報:醫學版,2004,25(1):5-18.

[11] 章軍建,黃建英,張曉琴.當歸對大鼠腦缺血半暗帶細胞凋亡的抑制作用[J].卒中與神經疾病,2001,8(1):8-10.

[12] 區炳雄,林海.當歸多糖對染鉛小鼠學習記憶及海馬區Bcl-2基因表達的影響[J].遼寧中醫雜志,2006,33(7):901-902.

[13] 林莉,劉希婧,榮霞,等.當歸對缺氧缺血性腦損傷幼年大鼠神經元的保護作用[J].四川解剖學雜志,2010,18(4):13-15.

[14] 劉凱,張選奮,張瑾,等.當歸水煎液對人臍靜脈內皮細胞增殖、凋亡及膠原合成的影響[J].中國美容醫學,2012,21(5):782-784.

[15] 雷燕,高倩,李悅山,等.黃芪、當歸及其組方促血管內皮細胞增殖作用的研究[J].中國中西醫結合雜志,2003,23(10):753-756.

(責任編輯：尹晨茹)

2015-03-09

鄧健男(1987-)，男，湖北省武漢市中醫醫院藥師，研究方向為方劑學。

R285.5

A

1673-2197(2015)13-0007-03

10.11954/ytctyy.201513003