桑杞腦康顆粒改善轉基因果蠅阿爾茨海默病模型學習記憶作用研究

楊巧巧，卿玉玲，桑 勤，趙嘉將，秦少容(.太極醫藥研究院，重慶 4047；.太極集團有限公司，重慶 4047)

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桑杞腦康顆粒改善轉基因果蠅阿爾茨海默病模型學習記憶作用研究

楊巧巧1，卿玉玲1，桑 勤1，趙嘉將1，秦少容2
(1.太極醫藥研究院，重慶 401147；2.太極集團有限公司，重慶 401147)

目的：觀察桑杞腦康顆粒對于阿爾茨海默(AD)果蠅模型學習記憶能力的影響。方法：采用Gal4/USA系統建立Aβ42果蠅模型；連續給藥后利用巴普洛夫嗅覺學習實驗觀察桑杞腦康顆粒對AD果蠅行為的影響。結果：桑杞腦康浸膏1.72mg/mL、0.172 mg/mL干預劑量可以顯著改善Aβ42果蠅的學習能力(P<0.001)，與臨床上用于治療AD的美金剛效果相當(P>0.05)。結論：桑杞腦康顆粒具有顯著改善Aβ42引起的AD果蠅學習缺陷的作用。

桑杞腦康顆粒；阿爾茨海默病；Aβ42蛋白；果蠅

桑杞腦康顆粒是太極集團的獨家專利產品(國藥準字B20050062),由桑椹、枸杞子、鹿茸、槐花、川芎5味中藥組成[1]，具有補養肝腎、健腦、益氣、活血功效，臨床用于老年肝腎陰虛、血瘀所致的腰膝酸軟、神倦乏力、記憶力減退、智能下降病情較輕者。本研究利用巴普洛夫嗅覺學習實驗觀察該藥對阿爾茨海默病(Alzheiemer’s Disease，AD)果蠅模型學習記憶的作用,為桑杞腦康顆粒臨床用于治療AD提供藥理研究基礎。

1 材料與儀器

1.1 動物

果蠅品系w1118(isoCJ1)；UAS-Aβ42；elav-GAL4c155均由清華大學鐘毅實驗室提供。

1.2 試劑

玉米粉(食品級)；蔗糖(分析純，北京化工廠，批號20090220)；瓊脂(細菌學分析級，石獅市環球瓊脂工業有限公司)；酒石酸鉀鈉(福晨化學， 批號20130620)；無水氯化鈣(北京現代東方精細化學品有限公司，批號20120302)；二甲基亞砜(DMSO)(Sigma 美國)。

1.3 藥物

桑杞腦康顆粒浸膏(太極醫藥研究院提供，含生藥1.701g/g)；美金剛(memantine)(Sigma美國)。

1.4 儀器

行為自動化系統由卓凱組裝設計(自制)；行為刺激器(S48 Stimulator 美國GRASS Technologies)；溫濕度控制器(JotonTmaster變頻控制器，法國)。

2 方法

2.1 實驗環境控制

飼養和繁殖均在恒溫24℃、恒濕42% RH(Relative humidity)的蠅房；給藥期間在28℃恒溫、42%恒濕的保溫箱內飼養；測試在恒溫25℃、恒濕70%，避光的行為房中進行。

2.2 AD果蠅模型建立

w1118(isoCJ1) 作為實驗的對照組背景果蠅，為方便起見在報告中用“2U”代表。致病性 Aβ42蛋白 (UAS-Aβ42;referred as H29.3)通過雜交在全腦表達的啟動子Gal4 line,elav-GAL4c155 (P35)與攜帶Aβ42的UAS品系獲得。因此對照組果蠅和疾病組果蠅通過圖1、圖2所示雜交獲得，本研究所用果蠅均為雄性[2]。

圖1 對照組果蠅雜交

圖2 疾病組果蠅雜交

2.3 分組

①野生型對照組[w1118(isoCJ1),2U]；②遺傳背景對照組(2U*H29.3)；③ Aβ42疾病對照組：P35*H29.3；④陽性藥物對照組(喂美金剛100μM， PC)；⑤桑芪腦康高劑量組(SQNK1)；⑥桑芪腦康低劑量組(SQNK2)。

2.4 給藥

SQNK1的母液濃度是由100%DMSO配置浸膏 172mg/mL，而SQNK2是用100%DMSO再稀釋SQNK1 10倍。在配制工作液時，利用含有4%的蔗糖水將各個母液稀釋100倍。因此，SQNK1的工作液濃度為1.72mg/mL，SQNK2的工作液濃度為0.172mg/mL。另外，對照組果蠅喂含有1%DMSO的蔗糖水。果蠅羽化后的第1天將對照組果蠅及疾病組果蠅和待喂藥組果蠅通過二氧化碳麻醉后，挑選正確性狀的果蠅在含有食物的玻璃管中。所喂藥物在挑蠅第2天配制并與配制當天給果蠅喂藥。每日果蠅喂藥4h，從挑出果蠅的第2天一直喂藥至第8天。

2.4 巴普洛夫嗅覺學習測試[3-4]

實驗在恒溫25℃、恒濕70%避光的行為房中進行[3]。在訓練階段，將100只左右的果蠅裝入安置有銅網交叉電極的訓練管，先后通入3-辛醇(3-octanol，OCT，Fluka)和4-甲基環己醇(4-methylcyclohexanol，MCH，Fluka)兩種氣味各60s，中間間隔45s的新鮮空氣。在通入第1種氣味(condition stimulus,CS+)的同時給予果蠅60V的脈沖電擊刺激(US，脈沖時長1.5s，間隔3.5s)。通入第2種氣味(CS-)時不給予電擊。如此完成1個訓練周期。

完成1個訓練周期的果蠅被立即轉移到T-Maze的選擇點，同時從相對的兩個方向通入CS+和CS-。經過2min的選擇后兩側的果蠅被分別收集，麻醉或處死后進行計數。

分別使用OCT和MCH作為CS+進行訓練和測試，得到的兩個PI的平均值作為一次實驗的PI值使用。PI=0表示測試中果蠅對于兩種氣味的選擇為50∶50，即沒有形成記憶；PI=100表示測試中果蠅全部逃避伴隨電擊的氣味，即完美記憶。行為指數(Performance index，PI)的計算公式為：PI=[(CS-)-(CS+)]/[(CS-)+(CS+)]×100。

在每次實驗前，測試操作者將首先利用野生型w1118果蠅測試系統運行，只有野生果蠅的短時記憶達到70以上，才認為測試系統正常可以進行后面的測試。為了避免測試者因知道測試藥物的果蠅順序而造成誤差，本實驗采用雙盲模式，即測試者不知道所測藥物及其喂藥順序。

3 結果

3.1 Aβ42果蠅存在學習記憶缺陷

給予1%DMSO糖水的各組果蠅，結果顯示Aβ42果蠅P35*H29.3組(n=12)PI值較低，表明Aβ42果蠅存在著明顯的學習記憶缺陷，與2U(n=6)和2U*H29.3(n=12)對照組比較，差異有顯著統計學意義(P<0.001)，表明Aβ42導致了果蠅嗅覺學習記憶的缺陷，見圖3。

3.2 桑杞腦康顆粒改善Aβ42果蠅的學習能力

結果顯示3個給藥組PC(n=12)、SQNK1(n=8)、SQNK2(n=8)的PI值均升高，與Aβ42疾病對照組相比，差異有顯著統計學意義(P<0.001),見圖3。

注：與Aβ42果蠅相比，###P<0.001；與Aβ42果蠅相比，***P<0.001。

圖3 桑杞腦康顆粒對Aβ42果蠅學習能力的影響

4 討論

AD是常見的癡呆類型，是一種和年齡相關的慢性進行性退行性腦部疾病。臨床表現為記憶障礙、失語、失用、失認、視空間技能損害、抽象思維和計算力損害、人格和行為的改變等。目前AD的確切發病機制尚不清楚，相關研究表明中樞膽堿能神經元數量的減少、ACh受體敏感性降低、ACh通路的解剖異常等都可導致學習記憶功能障礙[5]。AD的特征性病理學改變是細胞外淀粉樣斑塊和細胞內神經纖維結。AD分子機制的研究，揭示了APP的剪切→Aβ的生成→Aβ的沉積→老年斑的形成及其伴隨神經元的損傷是AD病理機制的中心環節。Aβ42的聚集性較Aβ40更強，Aβ42是淀粉樣斑塊的核心成分。

果蠅是進行脊椎動物和非脊椎動物遺傳學和細胞生物學研究的一種重要模式生物。從1918年利用果蠅模型研究黑色素沉著細胞瘤以來，絕大部分人類遺傳及變性疾病，如腫瘤、神經變性病、睡眠障礙、糖尿病和肥胖癥等主要病理改變都在果蠅模型上成功重現[6]。同時，果蠅的生命周期只有10天，提供了短時間內對AD病變全過程進行研究的可能[7]。

本研究選用的是一種表達人源Aβ42蛋白的UAS品系，以及能在神經細胞中特異性表達Gal4蛋白的elav-GAL4c155品系，只需要將這兩種品系的果蠅進行一次雜交，就可以在子代果蠅神經細胞中大量表達人源Aβ42。已有研究表明，這種Aβ42果蠅表現出明顯的年齡依賴性的短時記憶能力缺陷、寡聚體和纖維化沉積和顯著的神經元凋亡[8-9]。本研究采用的Aβ42果蠅，與野生型和遺傳背景對照組相比，也表現出學習能力的缺陷(P<0.001)。

本研究采用果蠅巴普洛夫嗅覺逃避條件反射范式檢測果蠅認知功能的水平，該行為范式在果蠅行為學研究領域已被廣泛使用，是經典的檢測果蠅聯想學習記憶能力的方法[3]。AD患者最先表現出的認知功能缺陷是對于新記憶形成的障礙，所以本研究以單詞訓練后產生的學習能力(又稱為瞬時記憶)作為檢測指標。

在本研究中，給予轉基因AD果蠅模型桑杞腦康浸膏1.72mg/mL、0.172 mg/mL干預劑量可以顯著改善Aβ42果蠅的學習能力(P<0.001)，與臨床上用于治療AD的美金剛效果相當(P>0.05)。同時本實驗采用雙盲模式，即測試者不知道所測藥物及其喂藥順序，降低了實驗系統誤差。

利用AD轉基因果蠅，初步證明了桑杞腦康顆粒具有改善轉基因果蠅阿爾茨海默病模型學習記憶的作用。AD發病機制復雜，多種致病機制相互作用，中藥多成分多靶點起效，桑杞腦康顆粒補肝腎、健腦，用于治療老年癡呆的作用機制還需要在更高級的哺乳動物模型上進一步驗證[10]，為臨床用藥提供藥理研究基礎。

[1] 重慶大易科技投資有限公司.一種藥物組合物及其制備方法和質量控制方法[P].中國專利:2005100707352,2006 -11- 22.

[2] WANG LI,CHIANG HC.Epidermal growth factor receptor is a preferred target for treating amyloid-β-induced memory loss[J].ProcNatlAcadSci USA，2012，109(41):16743-16748.

[3] TULLY T,QUINN WG.Classical conditioning and retention in normal and mutant Drosophila melanogaster[J].J Comp Physiol A,1985(157):263-277.

[4] TULLY T,BOYNTON SC.Genetic dissection of consolidated memory in Drosophila[J].Cell,1994(79):35-47.

[5] 徐金靜，方力群，趙春慧，等.β淀粉樣蛋白對阿爾茨海默病轉基因果蠅認知功能的影響[J].國際腎經病學神經外科學雜志，2013 40(2)：101-104.

[6] JEIBMANN A,PAULUS W.Drosophila melanogaster as a model organism of brain diseases[J].Int J.Mol Sci,2009,(10):407-440.

[7] 譚燕，季宇彬，趙簡.阿爾茨海默病轉基因果蠅模型的研究進展[J].藥學學報，2013， 48(3)：333-336.

[8] IIJIMA K,LIU HP,CHIANG AS,et al.Dissecting the pathological effects of human Abeta40 and Abeta42 in Drosophila: a potential model for Aizheimer’s disease[J].Proc Acad Sci USA,2004(101):6623-6628.

[9] IIJIMA K,CHIANG HC,HEARN SA,et al. Abeta42 mutants with different aggregation profiles induce distinct pathologies in Drosophila[J].PLoS One,2008(3):e1703-1703.

[10] 樂衛東，李靚.阿爾采末病模式生物研究進展[J].中國新藥與臨床雜志， 2006,25(9)：649-654.

(責任編輯：宋勇剛)

Effects of Sangqi Naokang Granules on the Learning and Memory Ability of Transgenic Alzheimer’s Disease of Drosophila Model

Yang Qiaoqiao1,Qing Yuling1,Sang Qin1,Zhao Jiaojiang1,Qin Shaorong2
(1.Taiji Pharmacetical Research Institute,Chongqing 408000,China；2.Taiji Group，Chongqing 401147,China)

Objective:To observe the effect of Sangqi Naokang Granules on the Learning and Memory Ability of Transgenic Alzheimer’s Disease of Drosophila Model.Methods:With an extensively characterized Pavlovian olfactory aversive conditioning,the effect of feeding Sangqi Naokang in Aβ42-expressing drosophila operated by Gal4/USA system was probed.Results:1.72mg/mL、0.172 mg/mL Sangqi Naokang Extract can significantly Improve the learning and memory ability of Transgenic Alzheimer’s Disease of Drosophila Model(P<0.001).Conclusion:Sangqi Naokang Granules can significantly rescue the learning and memory loss induced by Aβ42.

Sangqi Naokang Granules; Alzheimer’s Disease; Aβ42; Drosophila

2015-03-17

楊巧巧(1971-)，女，碩士，太極醫藥研究院高級工程師，研究方向為中藥新藥項目引進和研發。E-mail：qiaoqiaoyangtaiji@163.com

R285.5

A

1673-2197(2015)15-0017-03

10.11954/ytctyy.201515006