中心組合-效應面法優選黔產鐵莧菜總黃酮超聲提取工藝

蒙慧彤，李雪營，趙鴻賓，魏學軍(黔南民族醫學高等專科學校，貴州 都勻 558000)

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中心組合-效應面法優選黔產鐵莧菜總黃酮超聲提取工藝

蒙慧彤，李雪營，趙鴻賓，魏學軍*
(黔南民族醫學高等專科學校，貴州 都勻 558000)

目的：優選黔產鐵莧菜總黃酮的超聲提取工藝。方法：以總黃酮轉移率為響應值，在單因素試驗基礎上，采用中心組合-效應面法研究液固比、乙醇濃度、超聲時間及其交互作用對總黃酮轉移率的影響。結果：最優提取工藝參數為：乙醇濃度70%，用量33倍，提取2次，每次31min。結論：本試驗優選的提取工藝穩定可行。

黔產鐵莧菜；總黃酮；中心組合；效應面法；提取工藝

鐵莧菜為大戟科植物鐵莧菜AcalyphaaustralisL.的干燥全草,含黃酮、生物堿、鞣質等化學成分，具有清熱利濕、收斂止血的功能[1]。由于采集方便，療效顯著，在貴州黔南苗族聚集區應用廣泛，苗藥亦稱“海蚌含珠”[2]。研究表明，其所含總黃酮具有抗菌、消炎、抗衰老和增強機體免疫等作用[3-6]，具有良好的開發利用前景。本文首次采用中心組合-效應面法(CCD-RSM)對影響黔產鐵莧菜總黃酮超聲提取的因子及因子間的關系進行研究，優選提取工藝參數和建立預測模型，為鐵莧菜的進一步開發利用提供實驗性理論依據。

1 儀器與試藥

Cary-100型雙光束紫外可見分光光度計(北京安捷倫公司)；SY-1000型超聲波提取儀(北京西化儀公司)；OR型低速離心機(德國HERAEUS公司)；AE240型電子天平(瑞士METTLER公司)。蘆丁對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：100080-200707)，其他試劑均為分析純。鐵莧菜藥材采于本校藥用植物園，經鑒定為大戟科植物AcalyphaaustralisL.鐵莧菜的干燥全草，樣本留存于本校中藥標本室。

2 方法與結果

2.1 鐵莧菜總黃酮含量測定

2.1.1 對照品溶液制備 精密稱取一定量蘆丁對照品，加入60%乙醇溶解并于50mL容量瓶中定容，搖勻后得 0.102 4mg/mL的蘆丁對照品液。

2.1.2 標準曲線的制備 精密移取蘆丁對照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL分別置于10mL容量瓶中，加60%乙醇至5mL，加5%亞硝酸鈉溶液0.5mL，搖勻放置6min，再加10%硝酸鋁溶液0.5mL，搖勻放置5min，加4%氫氧化鈉溶液4mL，搖勻放置12min。另取2.0mL蒸餾水作為空白對照，在515nm處分別測定吸光度，以蘆丁濃度(C)為橫坐標，吸光度(A)為縱坐標，繪制標準曲線，線性方程為：A = 7.498 3C + 0.002 2，R=0.999 5。試驗結果表明對照品在10.24～61.44μg范圍內線性關系良好。

2.1.3 供試品溶液制備 精密稱取過3號篩干燥至恒重的鐵莧菜粉末1.0g置具塞試管中，按單因素考察試驗條件和中心組合試驗安排進行超聲提取，趁熱抽濾，濾液于水浴上濃縮至無醇味，放涼后加60%乙醇定容至50mL容量瓶中，搖勻，冷藏備用。

2.1.4 總黃酮含量測定 精密移取上述供試品溶液2.0mL，按“2.1.2”項標準曲線制備條件測定總黃酮，計算總黃酮轉移率(mg/g)。

2.2 單因素考察

2.2.1 液固比 按“2.1.3”制備方法取樣5份，在70%乙醇濃度、超聲10min和超聲1次的固定條件下，分別用10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1的液固比提取，按“2.1.4”項測定。結果總黃酮轉移率分別為2.81、3.14、3.32、3.37、3.38mg/g，轉移率隨液固比的增加而逐漸升高，超過30∶1后升高不明顯，這與總黃酮的溶出漸趨平衡有關，從縮短濃縮時間的角度考慮，選擇30∶1液固比為宜。

2.2.2 乙醇濃度 按“2.1.3”制備方法取樣5份，在液固比 30∶1、超聲10 min和超聲1次的固定條件下，分別采用50%、60%、70%、80%、90%乙醇提取，按“2.1.4”項測定。結果總黃酮轉移率分別為2.70、3.67、3.55、3.13、2.67mg/g，轉移率在乙醇濃度超過60%后呈逐漸降低趨勢，這與使用高濃度乙醇導致脂溶性雜質溶出增多，產生競爭抑制作用有關，故選擇60%乙醇作為提取溶劑。

2.2.3 超聲時間 按 “2.1.3”制備方法取樣5份，在60%乙醇濃度、液固比30∶1和超聲1次的固定條件下，分別提取10、20、30、40、50min，按“2.1.4”項測定。結果總黃酮轉移率分別為3.23、3.94、4.30、4.35、4.06mg/g，提取超過30min后，轉移率先升后降，原因與時間過長，乙醇揮發增多，降低了提取溶劑的濃度有關，故選擇超聲提取30min。

2.2.4 超聲次數 按“2.1.3”制備方法取樣3份，在60%乙醇濃度、液固比30∶1和超聲時間30min的固定條件下，分別提取1、2、3次，按“2.1.4”項測定。結果總黃酮轉移率分別為3.93、4.61、4.70mg/g，提取2次和3次差異不明顯，從節約資源和縮短生產周期的角度考慮，選擇提取2次為宜。

2.3 提取工藝條件篩選與結果

2.3.1 中心組合設計 綜合單因素試驗結果，選取液固比、乙醇濃度、超聲時間對總黃酮轉移率有顯著影響的三個因素，確定各因素的上、下限，按中心組合確定因素及水平，見表 1。采用中心組合將因素水平設計成 15個實驗組，其中 12個為析因實驗，3個為中心實驗，用以估計實驗誤差，實驗結果見表 2。

表1 因素水平

表2 星點設計實驗結果

2.3.2 效應面分析方案及結果 將所有條件和實驗結果經 SAS RSREG回歸，因子經過回歸擬合，得回歸方程為：Y=4.61+0.516 3X1-0.285 0X2+0.151 3X3-0.703 8X1X1+0.315 0X1X2-1.241 3X2X2+0.057 5X1X3-0.130 0X2X3-0.628 8X3X3。

回歸方程中各變量對響應值影響的顯著性用F檢驗判定，P值(概率)越小，則響應變量的顯著程度越高，P<0.05表示顯著影響，P<0.01表示影響極顯著。回歸分析結果見表3。

表3 回歸分析結果

分析結果顯示，模型回歸P為0.004 0，說明模型顯著可靠。液固比 X1、X1的平方項、X2的平方項、X3的平方項對總黃酮轉移率影響極顯著(P<0.01)；乙醇濃度 X2對總黃酮轉移率影響顯著(P<0.05)。模型的回歸系數R2=0.964 6，說明總黃酮轉移率變化的96.46%來自所選因變量，即液固比、乙醇濃度、超聲時間的值。各因素對總黃酮轉移率影響的順序是：液固比(X1)﹥乙醇濃度(X2)﹥超聲時間(X3)。

2.3.3 響應面優化和預測 利用Design Expert7.0軟件，通過多元回歸方程作出對總黃酮轉移率影響顯著的兩個因素的響應面圖和等值線圖，響應面圖的曲面頂端為最優值，結果見圖 1。由回歸方程解得實驗最優工藝條件為：液固比33.46∶1，乙醇濃度59%，超聲時間31.21min。在此條件下，鐵莧菜總黃酮轉移率理論值預測可達4.63mg/g。

圖1 Y=f(X1,X2)的響應面圖和等高線圖

2.3.4 驗證實驗 為便于實際操作，將CCD-RSM求得的最優條件下整理為：液固比33∶1，乙醇濃度60%，超聲時間31min。按此條件對鐵莧菜總黃酮平行提取5份，結果見表4。

表4 驗證實驗結果 (n=5)

3 討論

目前鐵莧菜總黃酮的提取工藝均采用正交試驗設計進行優選[5-6]，此設計方法是基于影響因素與總黃酮轉移率呈線性模型的設計，即研究因子與響應值之間的關系，忽視了在最佳試驗條件附近影響因素間的非線性變化，即因子與

因子之間的相互關系，因此預測性較差。CCD-RSM是采用多元二次回歸方法作為函數估計的工具，研究因子與響應值之間、因子與因子之間的相互關系，通過對回歸方程的分析來尋求最優工藝參數，解決多變量問題的一種統計方法，具有良好的直觀性、方便性及預測性，可用于藥學領域內的相關研究[7-10]。

驗證試驗表明，按整合后的工藝進行提取，實際轉移率與理論轉移率相對誤差為1.30%，RSD值為0.28%，說明此工藝是科學、合理的。本試驗在單因素考察的基礎上，對同批次樣本開展了正交試驗優選，結果顯示總黃酮平均轉移率為4.16mg/g，較CCD-RSM法試驗結果4.57mg/g低，此結果驗證兩種方法間確實存在一定差異性。

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[2] 邱德文，杜江.中華本草(苗藥卷)[M].貴陽：貴州科技出版社，2005：456-457.

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(責任編輯：魏 曉)

Optimization on Extraction of Total Flavonoids from Acalypha Astralis L. in Guizhou with Ultrasonic Wave by Central Composite Design-Response Surface Methodology

Meng Huitong，Li Xueying， Zhao Hong-bin，Wei Xuejun*
(Qiannan Medical College for Nationalities, Duyun 558000 China)

Objective:To study the optimum condition of extraction for the total flavonoids in Acalypha Astralis by central composite design-response surface methodology.Methods:Based on the single factor test，we study the effluence of liquid-solid ratio，ethanol concentration and ultrasonic time also with its interaction on the transfer rate of total flavonoids which was the response value.Results:The content of extraction conditions was 70% ethanol，ultrasound 33 min for 2 times，and 31 times the amount of solvent.Conclusion:In this study，the preferred extraction process is stable and feasible.

Acalyphaastralis；Total Flavonoids；Central Composite Design；Response Surface Methodology；Extraction Process

2015-03-17

貴州省教育廳自然科學研究基金項目(20090119)

蒙慧彤(1987-)，女，黔南民族醫學高等專科學校助教，研究方向為天然藥物開發應用。

魏學軍(1972-)，男，黔南民族醫學高等專科學校副教授，研究方向為中藥與民族藥質量控制研究。E-mail：qndywxj@163.com

R284

A

1673-2197(2015)15-0026-03

10.11954/ytctyy.201515010