東洲島絲瓜田根結線蟲病害的調查與研究

李玉中，王 麗，陳曉華，滕 濤，周東升，劉 最，王 彤

（1.衡陽師范學院 生命科學系 湖南 衡陽 421008；2.蒸湘區西站路小學 科學教研組 湖南 衡陽 421001）

植物寄生線蟲是一類重要的植物病原物，每年給全球農業造成約1570億美元的經濟損失［1］。常見根結線蟲有四個種類即南方根結線蟲（M.incognita）、北方根結線蟲（M.hapla）、爪哇根結線蟲（M.javanica）和花生根結線蟲（M.arenaria）。據不完全統計，根結線蟲的寄主植物多達3000多種，包括經濟、糧食、果樹、蔬菜、花卉等作物，其中危害最為嚴重的是茄科、葫蘆科和十字花科等植物［2－3］。發病田的寄主常年減產15%～20%，嚴重時達到70%以上［4］。2011—2013年，在衡陽地區果蔬病害的調查過程中，發現東洲島絲瓜上根結線蟲病害發生嚴重，縮短了絲瓜的掛果期，降低了絲瓜的產量和品質。本文對引起該病的病原進行了鑒定，對發病土壤和病根的優勢真菌進行了分離鑒定，并測定了其對致病線蟲卵孵化的影響。分析了發病嚴重的原因，為今后東洲島根結線蟲病的防治提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病樣

感染根結線蟲病害的東洲島絲瓜根及其根際土壤。

1.1.2 培養基及配制

玉米粉瓊脂培養基：稱取20g玉米粉，加入1000mL蒸餾水，微火煮沸30min后，經過4層紗布過濾，加瓊脂粉17g后融化補足水量至1000mL。

馬丁氏瓊脂培養基：稱取葡萄糖10g、蛋白胨5g、磷酸氫鉀1g、氯化鎂0.5g依次加入700mL的蒸餾水中加熱待融化后加入16g瓊脂粉補足水至1000mL。

馬丁氏液體培養基：稱取葡萄糖5g加入400mL自來水中，之后依次加入蛋白胨0.25g，磷酸二氫鉀0.5g，氯化鎂0.25g定容至500mL。

以上培養基配制好后分裝三角瓶，121℃滅菌20min，取出待用。

雙抗玉米粉瓊脂培養基：在倒平板前，每100mL培養基中加0.02g青霉素和0.02g硫酸鏈霉素。

1.2 方法

1.2.1 田間病害調查及樣品采集

每年絲瓜收獲末期，在東洲島大面積種植絲瓜的地塊進行5點取樣，每點取10株，共調查50株。將調查株連根拔起，根據馮志新的根結9級記載標準［5－6］，記錄根結發生情況。利用下面公式計算根結指數和發病率，并拍攝田間發病癥狀。

采集發病嚴重的絲瓜根及其根際土樣，分裝于自封袋中，帶回實驗室放于4℃冰箱保存待用。

1.2.2 病原線蟲的分離和鑒定

將病根用自來水沖洗表面附著的土壤或雜質，置于培養皿中，加少許清水，在體式顯微鏡下，用挑針挑取病原線蟲雌蟲放于滴有1小滴1%肥皂的載玻片上，在體式顯微鏡下，用解剖刀去掉雌蟲頭部，適當擠壓去掉雌蟲體內的組織，切除尾部多余的部分，使得留下略大于會陰花紋大小的一層角質膜，使切口向下，蓋上蓋玻片，放在顯微鏡下用40倍鏡進行觀察。根據會陰花紋的形態特征鑒定根結線蟲的種類。

1.2.3 發病田優勢真菌的分離和鑒定

將田間采集的病根，自來水沖洗，在體式顯微鏡下挑取顏色較深的卵塊和成蟲。將挑取到的卵塊用1%NaClO消毒3min，并用力振蕩使卵粒分散，再經滅菌水沖洗3次，獲得表面消毒卵粒。將表面消毒的卵粒、直接挑到的成蟲和顏色較深的卵囊分別接入雙抗玉米粉瓊脂培養基平板上，25℃培養3—5d，待在其周圍長出菌絲，從菌落邊緣挑取少量菌絲至馬丁氏培養基純化保存。

土壤中真菌的分離參考李玉中等人［7］的方法，將從線蟲體和土壤分離到的真菌進行純化培養，根據菌落特征、菌絲形態、分生孢子形態及其大小等進行鑒定。

1.2.4 優勢真菌對根結線蟲卵的寄生性測定

卵的獲取方法：取田間病根在顯微鏡下挑取卵囊完好的卵塊，消毒方法同1.2.3，經表面消毒卵粒用無菌水洗3次，再滴加無菌水配制成2000個／m L卵懸浮液。

卵致病性測定參考劉國坤等［9］人的方法，并做適當修改。具體做法：優勢真菌分離物在馬丁氏培養基平板上25℃ 暗培養7d后 ，無菌水漂洗菌落表面，配制孢子懸浮液 （106個／m L）。在直徑9 cm培養皿中加人 WA 10mL制平板，其上分散滴加3滴（每滴10μL）鐮刀菌孢子懸浮液，封口保濕，25℃暗培養；待產生小菌落后，在菌落邊緣滴加10 μL卵懸浮液（每皿加3次），重新封口保濕，25℃暗培養7d后，在倒置顯微鏡下觀察卵的寄生情況，并計算寄生率。

1.2.5 優勢真菌發酵液對根結線蟲卵孵化的影響

取2mL優勢菌株106個／mL的孢子懸液分別加入馬丁氏液體培養液中，25℃120r／min培養7d，濾除菌絲，取慮液向直徑6cm的培養皿中加入5 ml，再添加30～40個表面消毒的卵粒，封口膜封口，置于25℃培養，培養72h，觀察蟲卵孵化狀況，并計算蟲卵孵化率。處理設3個重復，以無菌水為對照。

2 結果與分析

2.1 田間發病情況

東洲島絲瓜田中發病嚴重的絲瓜根，其上根結幾乎遍布整個根系（圖1A）。根結線蟲侵染致死的絲瓜根腐爛，且其上長出大量的白色菌絲（圖1B）。用帶根結的絲瓜根際土壤種植芹菜，可以引起芹菜的嚴重發?。▓D1C）。

圖1 根結線蟲危害癥狀

連續3年的田間調查表明：東洲島絲瓜根結線蟲病的發病率連年上升，2013年根結發病率達46%，且病情嚴重，根結指數達45，感病植株的生長周期明顯縮短，嚴重影響了絲瓜的產量。

表1 2011—2013年東洲島絲瓜田根結發病情況

2.2 雌蟲會陰花紋特征

從絲瓜根結中分離的雌成蟲透明或呈乳白色，淡黃色，梨形。經會陰花紋觀察發現，該蟲會陰花紋背弓高聳，似方形，非常明顯，背弓由平緩形到波浪形的線紋組成，有些線紋無明顯的測線，在線紋的側面分叉。其特征與王曉瑋［10］描述的南方根結線蟲會陰花紋特征相似，鑒定此病原為南方根結線蟲（Meloidogyne.Incognita）。

2.3 優勢菌株的分離鑒定

從直接挑取到的成蟲和顏色較深的卵囊分離出的真菌和土壤分離出的優勢真菌從形態判斷為同一種。該菌在馬丁氏瓊脂培養基上25℃培養3d，菌落呈白色，菌絲呈密集絲狀體，菌絲為無色且有隔。其分生孢子梗直立，圓形，表面光滑或有凸起，孢子大多著生于頂端。分生孢子呈卵形、橢圓形或鐮刀形，根據形態初步判斷該菌為鐮刀菌（Fusarium sp.）（見圖2）。

圖2 鐮刀菌的分生孢子形態

2.4 優勢真菌對根結線蟲卵的寄生能力

接種南方根結線蟲卵7d后，鐮刀菌對卵沒有明顯的寄生現象。有的卵菌絲蔓延于卵殼表面但沒有菌絲穿透卵殼，不影響二齡幼蟲的孵化。

2.5 優勢真菌發酵液對根結線蟲卵孵化的影響

鐮刀菌的發酵濾液中根結線蟲卵的平均孵化率為23.9%，而對照實驗組無菌水中卵的平均孵率為10.09%。鐮刀菌的發酵濾液對根結線蟲卵的孵化有一定的促進作用。（見表2）

3 結論與討論

（1）本文根據雌蟲會陰花紋的形態特征，將衡陽市東洲島絲瓜根結病原鑒定為南方根結線蟲。成飛雪等［11］研究發現，在湖南省侵染蔬菜的根結線蟲種類中，南方根結線蟲最具普遍性，為優勢病原種群，占87%。本研究也證實了這一點，說明南方根結線蟲在湖南省發生普遍。

（2）劉國坤等人［9］的研究表明：不同的鐮刀菌對卵的寄生能力不同，有的菌株對胚胎期卵的寄生率高達90%，有的分離物對卵無寄生能力。段玉璽等人［12］的研究也證實不同的鐮刀菌菌株對南方根結線蟲卵的孵化抑制效果不同。本實驗從雌蟲體、卵塊和土壤中分離到的優勢真菌為同一鐮刀菌，該菌對根結線蟲卵無寄生能力，其發酵液對南方根結線蟲線蟲卵的孵化有一定的促進作用；在根結侵染腐爛的絲瓜根中生長繁茂，對絲瓜根組織腐爛具有一定促進作用，進而促使線蟲進入土壤，造成根結線蟲的再次侵染，增加了病害的嚴重度。這可能是導致東洲島絲瓜田根結線蟲病發生嚴重的原因之一。

（3）莫明和和牟貴平［13］、張克勤［14］等人從全國不同地區采集的土壤及植物根結，分離到多種的根結線蟲的天敵真菌，這些真菌對根結線蟲的生長和繁殖有重要的抑制作用。本實驗在土壤、蟲體及卵塊和卵上沒有分離到根結線蟲的天敵菌，這可能與東洲島特殊的地理環境所致。這可能是導致東洲島絲瓜田根結線蟲病發生嚴重的另原因之一。

（4）從連續三年的調查顯示，該田塊根結病害發生逐年呈上升趨勢，又鑒于南方根結線蟲侵染寄主廣泛，且土壤中缺乏自然天敵。建議防治策略：一、實行輪作，改種根結線蟲危害小的蔬菜或作物，如空心菜，小白菜等；二，使用藥劑處理土壤如阿維菌素，即可降低蟲口密度又可減少鐮刀菌的數量。

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