叔丁基對苯二酚激活骨髓間充質(zhì)干細胞蛋白酶體活性延緩復制性衰老*

宋慧芳，楊佳超，牛曉潔，陸　利(山西醫(yī)科大學人體解剖學教研室，山西太原030001)

叔丁基對苯二酚激活骨髓間充質(zhì)干細胞蛋白酶體活性延緩復制性衰老*

宋慧芳，楊佳超，牛曉潔，陸利△
(山西醫(yī)科大學人體解剖學教研室，山西太原030001)

［摘要］目的:探討叔丁基對苯二酚(tert-butylhydroquinone，tBHQ)在延緩骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)復制性衰老進程中的作用，以期為細胞移植治療提供數(shù)量充足的種子細胞。方法: 30 μmol/L tBHQ持續(xù)作用于體外傳代晚期BMSCs 4周，化學發(fā)光法測量蛋白酶體活性; CCK-8法檢測細胞活力; BrdU摻入實驗檢測細胞增殖能力;流式細胞術(shù)檢測細胞周期分布;衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶(senescence-associated β-galactosidase，SA-β-Gal)染色檢測衰老細胞百分比; Western blot檢測衰老相關(guān)蛋白P53表達變化。結(jié)果: 30 μmol/L tBHQ持續(xù)作用于傳代晚期BMSCs 4周后，蛋白酶體活性較DMSO溶劑對照組上調(diào)(21.96±1.98) % (P＜0.05)。CCK-8法顯示隨tBHQ濃度增加，細胞活力逐漸升高，至40 μmol/L達到平臺期，且至120 μmol/L未見明顯細胞毒性。BrdU摻入實驗顯示tBHQ組陽性細胞率與DMSO溶劑對照組比較，細胞增殖能力顯著提高(P＜0.05) ; tBHQ組細胞增殖指數(shù)也顯著高于DMSO組(P＜0.05)。tBHQ組SA-β-Gal陽性率較DMSO溶劑對照組顯著降低(P＜0.01)，且衰老相關(guān)蛋白P53表達量也較對照組下降(P＜0.05)。結(jié)論: tBHQ能夠通過提高蛋白酶體活性延緩因蛋白酶體功能障礙引起的BMSCs復制性衰老進程。

［關(guān)鍵詞］叔丁基對苯二酚;骨髓間充質(zhì)干細胞;復制性衰老

［修回日期］2015-04-07

骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)具有易分離培養(yǎng)、擴增純化、便于自體移植等特點，是醫(yī)學組織工程理想的種子細胞［1-2］。分離獲得的BMSCs數(shù)量有限，需體外擴增后用于移植治療。然而，在擴增培養(yǎng)中BMSCs出現(xiàn)復制性衰老［3-4］。我們近期的研究結(jié)果提示，蛋白酶體功能障礙是誘發(fā)BMSCs復制性衰老的重要因素［5］;過表達蛋白酶體功能亞單位PMSB5，提高蛋白酶體活性，能夠延緩BMSCs衰老進程［6］。

叔丁基對苯二酚(tert-butylhydroquinone，tBHQ)是一種人工合成的酚類強抗氧化劑，常作為食品添加劑廣泛應用于油脂食品中阻止食物油脂氧化變質(zhì)。已有研究證明tBHQ可以通過激活Nrf2/ARE信號通路，促進蛋白酶體的組裝與合成，提高蛋白酶體活性［7-9］。因此，本研究擬探討tBHQ對BMSCs細胞活力的影響，尋求抑制細胞衰老進程的有效手段。

材料和方法

1 BMSCs的體外培養(yǎng)

BMSCs購于Science Cell Research Laboratory，用10% FBS-DMEM培養(yǎng)基(內(nèi)含2 mmol/L L-谷氨酰胺，1×105U/L青霉素，1×105U/L鏈霉素)培養(yǎng)，細胞生長至90%融合時，0.25%胰酶(含0.02% EDTA)消化，1∶2傳代。晚期BMSCs即體外擴增14代以上的細胞，已出現(xiàn)復制性衰老表型［5］。

2主要方法

2.1tBHQ干預實驗30 μmol/L tBHQ持續(xù)作用于晚期BMSCs 4周，干預完成后即刻進行下游相關(guān)實驗; DMSO組為同樣濃度的溶劑對照組，持續(xù)作用4周。

2.2蛋白酶體活性測定Lysis buffer提取蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度，APT280試劑盒(Millipore)測定20S蛋白酶體活性。具體實驗步驟如下:避光96孔板中將30 μg蛋白與熒光底物混合至終體積100 μL，37℃避光孵育1.5 h，熒光光度計在380/460 nm處測定熒光強度反映蛋白酶體活性。

2.3CCK-8實驗檢測細胞增殖能力及細胞活力各組細胞以相同密度接種于96孔板(每孔2 000 個)，細胞貼壁后按檢測試劑盒操作，酶標儀檢測450 nm處吸光度(A)值。

2.4BrdU摻入實驗檢測細胞增殖能力細胞貼壁后，用含有10 μmol/L BrdU的10% FBS-DMEM培養(yǎng)72 h，4%多聚甲醛室溫固定20 min，2 mol/L鹽酸37℃水浴作用10 min使DNA變性，而后小鼠抗BrdU I 抗(1∶100，ABtech) 4℃孵育過夜，山羊抗小鼠熒光II 抗(1∶100) 37℃避光孵育2 h，DAPI室溫染核10 min，水溶性封片劑封片。Olympus熒光顯微鏡拍片、計數(shù)。

2.5碘化丙啶染色，流式細胞術(shù)觀察BMSCs細胞周期分布和細胞增殖指數(shù)細胞生長至80%～90%融合時，0.25%胰酶消化，PBS清洗2次，棄上清，輕彈管壁使細胞團分散后，快速加入2 mL預冷的70%乙醇固定4 h，1 000 r/min室溫離心5 min，PBS清洗1次，而后300目濾網(wǎng)過濾去除雜質(zhì)，1 000 r/min室溫離心5 min收集細胞，加入碘化丙啶工作液(50 mg/L碘化丙啶，10 mg/L RNase，1‰Triton X-100)，室溫避光孵育20 min，而后流式細胞儀檢測G0/G1、S、G2/M各期細胞分布，計算細胞增殖指數(shù)(proliferative index，PI)。

2.6衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶(senscence-associated β-galactosidase，SA-β-Gal)染色檢測細胞衰老水平細胞接種于24孔板(每孔10 000)，貼壁后按SA-β-Gal檢測試劑盒流程操作，顯微鏡觀察，計數(shù)，藍色著色的細胞即為衰老細胞，計算衰老細胞陽性率反映細胞衰老水平。

2.7Western blotRIPA buffer提取蛋白，20 μg總蛋白經(jīng)SDS電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，雜交袋中I抗4℃孵育過夜，辣根過氧化物酶標記II抗37℃孵育2 h，按照ECL說明書顯影曝光，ImageJ軟件計算灰度值。

3統(tǒng)計學處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)值以均數(shù)±標準誤(mean±SEM)表示，tBHQ干預組與DMSO溶劑對照組均數(shù)比較用兩配對樣本t檢驗，多組比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

1 tBHQ對晚期BMSCs蛋白酶體活性的影響

tBHQ 30 μmol/L持續(xù)作用于傳代晚期的BMSCs 4周，化學發(fā)光法測量蛋白酶體活性結(jié)果顯示，tBHQ組蛋白酶體活性上調(diào)21.96%±1.96%，與tBHQ溶劑對照組(DMSO組)比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，提示tBHQ能夠上調(diào)體外培養(yǎng)晚期骨髓間充質(zhì)干細胞蛋白酶體活性，見圖1。

Figure 1.The effect of tBHQ on proteasome activity of the latestage BMSCs.Mean±SEM.n=4.*P＜0.05 vs DMSO.圖1 tBHQ對傳代晚期BMSCs蛋白酶體活性的影響

2 tBHQ對傳代晚期BMSCs細胞活力、增殖潛能及細胞周期分布的影響

2.1tBHQ對晚期BMSCs細胞活力的影響及其劑量依賴性CCK-8實驗結(jié)果顯示，隨著tBHQ作用濃度增加(5 μmol/L～40 μmol/L)，細胞活力和增殖能力逐漸增強，至40 μmol/L到達平臺期并維持在較高水平。tBHQ濃度升高至120 μmol/L，仍未見細胞毒性反應，見圖2。

2.2tBHQ對晚期BMSCs增殖能力的影響B(tài)rdU摻入實驗顯示，tBHQ作用于晚期BMSCs，其BrdU陽性率較DMSO溶劑對照組顯著提高(P＜0.05)。提示tBHQ可以增強晚期骨髓間充質(zhì)干細胞的增殖能力，見圖3。

2.3tBHQ對晚期BMSCs細胞周期的影響流式細胞術(shù)檢測細胞周期分布，可見tBHQ組G0/G1期細胞較DMSO組減少，但S期和G2/M期細胞增多，細胞增殖指數(shù)較DMSO組顯著提高9.93%±1.61% (P＜0.05)，見表1。

Figure 2.The CCK-8 assay indicated that tBHQ promoted the late-stage BMSCs viability in a concentration-dependent manner.Mean±SEM.n=3.*P＜0.05 vs DMSO.圖2 tBHQ對晚期BMSCs細胞活力的影響具有劑量依賴性

Figure 3.The effect of tBHQ on the proliferation of late-stage BMSCs by BrdU incorporation.Mean±SEM.n=15.*P＜0.05 vs DMSO.圖3 BrdU摻入法檢測tBHQ對傳代晚期hBMSCs增殖能力的影響

表1　流式細胞術(shù)檢測晚期BMSCs細胞周期分布Table 1.Cell cycle distribution of late stage BMSCs tested by flow cytometry (%.Mean±SEM.n=3)

3 tBHQ對傳代晚期BMSCs衰老表型的影響

3.1tBHQ對晚期BMSCs衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶活性的影響SA-β-Gal染色結(jié)果顯示，tBHQ作用于晚期BMSCs，其SA-β-Gal陽性率較DMSO溶劑對照組顯著降低(P＜0.01)，見圖4。

Figure 4.The effect of tBHQ on SA-β-Gal activity of the late-stage BMSCs.Mean±SEM.n=8.＊＊P＜0.01 vs DMSO.圖4 tBHQ對晚期BMSCs衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶活性的影響

3.2tBHQ對晚期BMSCs衰老相關(guān)蛋白P53表達的影響Western blot實驗結(jié)果顯示，tBHQ作用于晚期BMSCs，衰老相關(guān)蛋白P53的表達水平下降78.20%±8.18%，與DMSO溶劑對照組比較差異顯著(P＜0.05)，見圖5。

Figure 5.The effect of tBHQ on P53 expression in late-stage BMSCs.Mean±SEM.n=4.*P＜0.05 vs DMSO.圖5 tBHQ對晚期BMSCs P53表達的影響

討論

干細胞具有修復受損組織、器官，重塑機體生物學功能的作用，因而在移植應用中具有廣泛的前景。骨髓間充質(zhì)干細胞是成體干細胞的一種，具有多向分化潛能，同時具有低免疫原性，易分離培養(yǎng)、擴增純化，便于自體移植等優(yōu)點，是細胞治療和組織工程中理想的種子細胞，但其細胞數(shù)量的不足以及體外擴增中出現(xiàn)的復制性衰老及其伴隨的干性下降是限制其臨床應用的瓶頸［10-11］，因而尋找有效的方法和靶點延緩骨髓間充質(zhì)干細胞體外擴增中的復制性衰老進程是提高干細胞移植治療療效的關(guān)鍵，并可為其更廣泛而有效的臨床應用提供技術(shù)支撐。

已有研究顯示，干細胞的復制性衰老可能與其在體外擴增過程中基因穩(wěn)定性降低，端粒酶變短，氧化應激水平增高等多種因素有關(guān)，調(diào)節(jié)相應的ERK、MAPK、Akt等信號通路可以延緩干細胞復制性衰老進程［9，12-16］。本課題組前期研究結(jié)果顯示，蛋白酶體功能障礙與BMSCs的復制性衰老過程密切相關(guān)，通過藥物或轉(zhuǎn)基因的方式提高蛋白酶體的表達量及其活性可能是延緩骨髓間充質(zhì)干細胞復制性衰老的可能途徑［5-6］。因而本文擬尋找提高蛋白酶體活性，同時又是比較安全的方式來達到延緩骨髓間充質(zhì)干細胞復制性衰老。

tBHQ是一種人工合成的酚類強抗氧化劑，常作為食品添加劑廣泛應用于油脂食品中以阻止食物油脂氧化變質(zhì)。已有文獻報道應用tBHQ能夠通過激活Nrf2/ARE信號通路對抗氧化應激引起的神經(jīng)干細胞死亡，對神經(jīng)干細胞具有保護作用［8］;而Nrf2/ARE信號通路的激活可以參與泛素-蛋白酶體通路的調(diào)節(jié)，促進蛋白酶體的組裝與合成，提高蛋白酶體功能活性從而恢復成纖維細胞增殖活力［7］。我們將tBHQ作用于傳代晚期的骨髓間充質(zhì)干細胞，結(jié)果顯示其可以通過提高蛋白酶體活性，進而提高細胞增殖能力和細胞活力;減少衰老細胞陽性率，降低P53蛋白的表達量。關(guān)于P53蛋白的表達，我們的前期實驗結(jié)果［17］顯示傳代晚期BMSCs的P53表達水平較早期組顯著增加，是復制性衰老的主要表型之一。可見tBHQ可以作用于體外培養(yǎng)傳代晚期已出現(xiàn)復制性衰老的骨髓間充質(zhì)干細胞，通過提高干細胞蛋白酶體活性，逆轉(zhuǎn)或延緩骨髓間充質(zhì)干細胞復制性衰老進程。這與Arlt等［9］在腫瘤細胞中觀察到的應用tBHQ可通過激活Nrf2信號通路，提高蛋白酶體活性，從而起到抑制腫瘤細胞凋亡、提高其耐藥性的研究結(jié)果一致。可見在多種不同類型的細胞中，tBHQ都具有細胞保護作用。同時我們觀察到大劑量tBHQ干預下，骨髓間充質(zhì)干細胞未出現(xiàn)毒性反應，而其又是一種常用的食品添加劑，提示tBHQ可以作為一種比較安全的干預手段，延緩因蛋白酶體功能障礙引起的晚期BMSCs復制性衰老進程，從而為細胞移植治療和組織工程提供數(shù)量充足的種子細胞。

［參考文獻］

［1］畢涌，洪娟，李力群，等.重組質(zhì)粒pcDNA3-β-NGF的構(gòu)建及其轉(zhuǎn)染小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞生物學活性的研究［J］.中國病理生理雜志，2013，29(11) : 2082-2087.

［2］華平，劉家良，楊淞然，等.慢病毒介導的caspase-3沉默對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞增殖和凋亡的影響［J］.中國病理生理雜志，2013，29(8) : 1502-1507.

［3］Chen D，Shen H，He Y，et al.Synergetic effects of hBMSCs and hPCs in osteogenic differentiation and their capacity in the repair of critical-sized femoral condyle defects［J］.Mol Med Rep，2015，11(2) : 1111-1119.

［4］毛晨熙，陸地，孫成超.miR-193通過細胞周期相關(guān)蛋白調(diào)控大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的增殖能力［J］.中國病理生理雜志，2014，30(4) : 645-650.

［5］Lu L，Song HF，Zhang WG，et al.Potential role of 20S proteasome in maintaining stem cell integrity of human bone marrow stromal cells in prolonged culture expansion ［J］.Biochem Biophys Res Commun，2012，422 (1) : 121-127.

［6］Lu L，Song HF，Wei JL，et al.Ameliorating replicative senescence of human bone marrow stromal cells by PSMB5 overexpression［J］.Biochem Biophys Res Commun，2014，443(4) : 1182-1188.

［7］Suzanne Kapeta，Niki Chondrogianni，Efstathios S.Gonos.Nuclear erythroid factor 2-mediated proteasome activation delays senescence in human fibroblasts［J］.J Biol Chem，2010，285(11) : 8171-8184.

［8］Li J，Johnson D，Calkins M，et al.Stabilization of Nrf2 by tBHQ confers protection against oxidative stress-induced cell death in human neural stem cells［J］.Toxicol Sci，2005，83(2) : 313-328.

［9］Arlt A，Sebens S，Krebs S，et al.Inhibition of the Nrf2 transcription factor by the alkaloid trigonelline renders pancreatic cancer cells more susceptible to apoptosis through decreased proteasomal gene expression and proteasome activity［J］.Oncogene，2013，32(40) : 4825-4835.

［10］Yu KR，Lee JY，Kim HS，et al.A p38 MAPK-mediated alteration of COX-2/PGE2 regulates immunomodulatory properties in human mesenchymal stem cell aging［J］.PLoS One，2014，9(8) : e102426.

［11］Jeoung JY，Nam HY，Kwak J，et al.A decline in Wnt3a signaling is necessary for mesenchymal stem cells to proceed to replicative senescence［J］.Stem Cells Dev，2014，24(8) : 973-982.

［12］Ren J，Stroncek DF，Zhao Y，et al.Intra-subject variability in human bone marrow stromal cell (BMSC) replicative senescence: molecular changes associated with BMSC senescence［J］.Stem Cell Res，2013，11(3) : 1060-1073.

［13］Tümpel S，Rudolph KL.The role of telomere shortening in somatic stem cells and tissue aging: lessons from telomerase model systems［J］.Ann N Y Acad Sci，2012，1266: 28-39.

［14］Hao H，Chen G，Liu J，et al.Culturing on Wharton's jelly extract delays mesenchymal stem cell senescence through p53 and p16INK4a/pRb pathways［J］.PLoS One，2013，8(3) : e58314.

［15］Estrada JC，Torres Y，Benguría A，et al.Human mesenchymal stem cell-replicative senescence and oxidative stress are closely linked to aneuploidy［J］.Cell Death Dis，2013，4: e691.

［16］Choi SH，Jung SY，Yoo SY，et al.Regulation of ROS-independent ERK signaling rescues replicative cellular senescence in ex vivo expanded human c-kit-positive cardiac progenitor cells［J］.Int J Cardiol，2013，169(1) : 73-82.

［17］劉雪芹，宋慧芳，陸利.蛋白酶體功能障礙通過激活P53抑制人骨髓間充質(zhì)干細胞增殖［J］.中國病理生理雜志，2012，28(12) : 2250-2253.

(責任編輯:盧萍，余小慧)

tBHQ delayed replicative senescence by activating the proteasome system of BMSCs

SONG Hui-fang，YANG Jia-chao，NIU Xiao-jie，LU Li
(Department of Anatomy，Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China.E-mail: luli7300@126.com )

［ABSTRACT］AIM: To investigate the effect of tert-butylhydroquinone (tBHQ) on the replicative senescence of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs).METHODS: Late stage BMSCs were continuously treated with tBHQ at concentration of 30 μmol/L for 4 weeks and the cells were used for the following assays immediately.The proteasomal activity was determined by chemiluminescence method.The samples were subjected to CCK-8 assay and BrdU incorporation as well as flow cytometry analysis for analyzing the cell vitality and proliferation.Percentage of senescent cells was detected by senescence-associated β-galactosidase (SA-β-Gal) staining.The expression of P53 was measured by Western blot.RESULTS: After the continuous treatment of tBHQ (30 μmol/L) for 4 weeks，the proteasomal activity of late stage BMSCs increased by 21.96%±1.98% (P＜0.05).The cell vitality and survival were significantly increased with the increases in tBHQ doses till 40 μmol/L，and no cytotoxicity reaction with the increased dose of tBHQ till 120 μmol/L was observed.BrdU-positive cells，which represented the cell proliferation，were significantly increased (P＜0.05).The proliferation index was also significantly increased by flow cytometry analysis (P＜0.05).The SA-β-Gal positive cells and the expression of P53 were decreased (P＜0.05).CONCLUSION: tBHQ delays the proteasome dysfunction associated senescence progress of BMSCs by increasing the proteasomal activity.

［KEY WORDS］Tert-butylhydroquinone; Bone marrow mesenchymal stem cells; Replicative senescence

通訊作者△Tel: 0351-4135787; E-mail: luli7300@126.com

*［基金項目］國家自然科學基金資助項目(No.81200254) ;山西省回國留學人員科研資助項目(No.2014-033)

［收稿日期］2015-02-09

［文章編號］1000-4718(2015)09-1647-05

［中圖分類號］R339.3+8; R363.2

［文獻標志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.09.021