PCOS患者卵泡液微環境中的亞急性炎癥反應*

楊　星，黃　睿，梁曉燕(中山大學附屬第六醫院生殖醫學中心，廣東廣州510610)

PCOS患者卵泡液微環境中的亞急性炎癥反應*

楊星，黃睿，梁曉燕△
(中山大學附屬第六醫院生殖醫學中心，廣東廣州510610)

［摘要］目的:回顧性分析多囊卵巢綜合征(PCOS)患者及對照者卵泡液微環境中局部脂代謝紊亂及炎癥反應狀態及其形成機制。方法:比較2組患者外周血清脂代謝指標、性激素、炎癥細胞及炎癥介質水平差異;測定卵泡液中炎癥介質及載脂蛋白含量;分析卵巢顆粒細胞中炎癥介質及載脂蛋白基因表達。結果: PCOS患者具備典型肥胖、高脂血癥及高雄激素血癥，外周血中炎癥細胞及各類炎癥介質水平顯著增加;卵泡液中同樣具有顯著增加的炎癥細胞因子浸潤，顆粒細胞內炎癥介質及載脂蛋白基因表達增加。結論: PCOS組患者卵泡液內所含高水平載脂蛋白表明卵泡液內可能存在高脂蛋白狀態。循環中的高脂血癥及亞急性炎癥各類因子可能通過血清-卵泡液屏障主動滲透。顆粒細胞通過主動攝取(例如載脂蛋白A)抑或自主合成(如炎癥因子IL-1、IL-6及TNF-α等)等多種方式進行卵泡液局部微環境的穩態調節。卵子發育生理性卵泡液微環境的脂質代謝紊亂、炎癥細胞浸潤、高雄激素血癥等均可能影響到卵母細胞和胚胎的正常發育。

［關鍵詞］多囊卵巢綜合征;肥胖;亞急性炎癥反應;卵泡液

［修回日期］2015-06-18

多囊卵巢綜合征(polycystic ovarian syndrome，PCOS)是育齡期婦女最常見的內分泌疾病之一，發病率達6～10%［1］。臨床表現通常包括肥胖、高雄激素血癥、慢性無排卵、多囊樣卵巢、多毛、不孕和妊娠期間的并發癥增加。多囊卵巢綜合征本身是一類炎癥前狀態。大量研究表明PCOS患者血循環中致病性炎癥調節因子顯著增加［2］。PCOS婦女中約有38%～66%是肥胖者［3］。肥胖本身亦是一種慢性全身性炎癥狀態，脂肪細胞是機體重要的內分泌器官，可以分泌一系列的生物活性物質如脂聯素、瘦素、抵抗素、白細胞介素等，對促進炎癥狀態有重要作用［2］。肥胖者存在外周血炎性細胞因子水平增加以及外周血淋巴細胞數量和功能的改變［4］。各類因子分泌狀態的改變可能會引起PCOS患者一系列病理狀態產生。肥胖或多囊卵巢各自對卵母細胞質量和生育結局的影響是復雜的，且受多種因素影響。PCOS患者循環中炎性因子水平增加這種改變根源于PCOS本身，亦或是歸因于肥胖或腹部脂肪堆積尚未完全明確。

卵巢中卵泡液是卵子生長發育的生理性環境，卵子的生長發育，選擇及主導化過程均在卵泡液微環境中完成。卵泡液與血清之間存在血清-卵泡液屏障，具有一定的調節微環境穩態的能力。卵泡液微環境中具有源于血清的各類營養物質，提供卵子發育所需的能量底物，同時卵泡液中各類類固醇激素，垂體激素、細胞因子和生長因子的濃度關系到卵母細胞生長發育、受精率和早期胚胎發育潛能。被主導化而選擇的卵子其質量及發育潛能都與卵巢內及卵泡微環境中的細胞因子密切相關。

由于中國人更傾向于在較低的體重指數(body mass index，BMI)水平伴隨脂質代謝異常風險［5］，PCOS伴隨脂質代謝異常如何改變卵泡液微環境穩態研究匱乏。我們遂采用回顧性分析的辦法，納入進行輔助生育助孕治療的PCOS患者及對照人群作為研究對象，測定并分析PCOS患者卵泡液微環境中局部脂代謝紊亂及炎癥反應狀態，及探討其形成機制。

材料和方法

1研究對象

本研究納入在中山大學附屬第六醫院生殖中心進行助孕治療的患者共96名。其中包括符合2003年鹿特丹診斷標準的PCOS患者46名，以及年齡介于20～35歲、相匹配的對照組患者50名。對照組患者月經周期規則，BMI≤22 kg/m2，正常卵巢儲備，由于盆腔輸卵管因素或男方因素接受體外受精-胚胎移植治療。

2血清標本收集

月經期獲取空腹血清，羅氏電化學發光法測定基礎性激素水平，包括卵泡刺激素(follicle stimulating hormone，FSH)、黃體生成素(luteinizing hormone，LH)、睪酮(testosterone，T) ;同時測定甘油三酯(triglyceride，TG)、膽固醇(cholesterol，CH)、低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)、高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，HDL)、載脂蛋白A(apolipoprotein A，ApoA)和ApoB; ELISA測定血清超敏C反應蛋白(high-sensitivity C-reactive protein，hs-CRP)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素6(IL-6)等炎癥介質水平。

3人類卵泡液收集及檢測

獲取行體外受精-胚胎移植治療患者取卵時第一管清亮卵泡液4 000 r/min離心10 min后保存于－80℃。將卵泡液轉移至50 mL離心管，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，沉淀用無菌PBS洗2次，1 000 r/min離心5 min。用PBS重懸細胞，以1∶1體積緩慢加至50% Ficoll液，2 500 r/min離心20 min。可見中間白色云霧狀顆粒細胞團，管底紅細胞沉淀。吸取中間細胞層至新離心管，加入等量PBS洗1次。1 000 r/min離心5 min。棄上清。沉淀顆粒細胞保存于－80℃。后續進行卵泡液內炎癥細胞因子(IL-6、IL-1、TNF-α)及載脂蛋白(ApoA-I、Apo-AII、ApoB、ApoC、ApoE)含量測定。

4顆粒細胞內炎癥介質及載脂蛋白mRNA檢測

使用Qiagen公司RNeasy Micro Kit提取顆粒細胞中的RNA。紫外分光光度計測定所提RNA濃度，逆轉錄為cDNA。所測定的炎癥介質包括ApoA、ApoB、ApoE、IL-1、TNF-α及IL-6。于Rotor-GeneTM6000 (Corbett Research)進行real-time PCR反應。采用2－ΔΔCt方法定量分析基因表達。

5統計學處理

數據均采用均數±標準誤(mean±SEM)。統計學方法使用非配對t檢驗，使用GraphPad Prism 5.01軟件進行統計學分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1 PCOS患者血清中激素及代謝指標的變化

與對照組相比，PCOS組患者的BMI顯著增加，其中BMI達到肥胖標準者(BMI≥25 kg/m2) 19名，正常BMI者27名。基礎性激素具有典型的PCOS特征，即顯著增高的LH及睪酮水平，見表1。PCOS患者BMI的增高伴隨著外周血中甘油三酯及ApoB水平的顯著增加，而其余各類載脂蛋白及膽固醇脂與對照組相比差異均無統計學意義，見表2。

表1　患者一般情況及基礎性激素水平Table 1.The general characteristics and the levels of the gonadal hormones (Mean±SEM)

表2　外周血脂代謝指標Table 2.The indexes of lipid metabolism in peripheral blood (Mean±SEM)

2PCOS患者外周血的亞急性炎癥狀態

血液分析細胞計數提示PCOS患者外周血中存在顯著增加的亞急性炎癥反應，淋巴細胞和單核細胞和嗜酸性粒細胞、數量均有顯著增加。與此相伴隨的是異常增高的血清炎癥細胞因子，如hs-CRP、TNF-α及IL-6，見表3。

3 PCOS患者卵泡微環境中的亞急性炎癥介質水平

PCOS患者卵泡液中的載脂蛋白ApoA及ApoB顯著高于對照組，ApoC及ApoE水平的差異無統計學意義，同時卵泡液中同樣存在高水平的炎癥細胞因子IL-1及IL-6，TNF-α同樣在PCOS患者中具有增高趨勢，但差異不顯著，見圖1。

表3　外周血炎急性亞癥反應指標Table 3.The subate inflammation indexes in peripheral blood(Mean±SEM)

Figure 1.The lipid metabolism index and inflammatory cytokine levels in the follicular fluid.ApoA-I，ApoA-II，ApoB，IL-6 and IL-1 levels were significantly increased in the obese PCOS patients.Mean±SEM.n=20.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control.圖1卵泡液中脂質代謝指標及炎癥細胞因子水平的變化

4 PCOS患者卵泡液微環境中的炎癥介質基因表達異常

與卵泡液中增高的炎癥細胞因子水平相對應的是PCOS患者卵巢組織內顆粒細胞炎癥細胞因子IL-1、IL-6及TNF-α的mRNA表達增加。載脂蛋白ApoB表達增加，而ApoA及ApoE的mRNA表達差異不顯著，見圖2。

Figure 2.The mRNA expression of lipid metabolism index and inflammation cytokine genes in the granulose cells.The mRNA levels of ApoB，IL-1，IL-6 and TNF-α were highly expressed in the granulose cells from obese PCOS group.Mean±SEM.n=9.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control.圖2卵巢組織顆粒細胞內脂代謝及炎癥細胞因子相關基因的mRNA表達

討論

本研究所納入的PCOS患者平均BMI達到23.59 kg/m2，已經達到亞洲人種超重的標準［5］，具有典型高血脂及高雄激素血癥的內分泌紊亂狀態。既往大量研究表明，肥胖婦女血清代謝指標紊亂，導致血清膽固醇和非酯化脂肪酸濃度增高，出現高血糖和胰島素抵抗［6］。血清代謝變化可反映在卵泡液中，肥胖婦女的卵泡液內含有高水平的甘油三酯及脂肪酸。肥胖婦女卵泡液組成成分的改變可能會影響卵母細胞和卵丘顆粒細胞成熟過程及質量［7-8］，導致胚胎生理特征異常例如葡萄糖耐受不良和胚胎基因表達模式發生改變，可能減少胚胎植入率及隨后增加發育異常的潛在風險［9-10］。這些對生育的不良風險同樣存在于本研究所納入的PCOS患者中。

本研究測定了兩組患者血清及卵泡液中炎癥指標，提示PCOS患者外周血中慢性炎癥指標hs-CRP及各類炎癥細胞數量增加，其中單核細胞主要來源方式是機體堆積的脂肪組織，可促進巨噬細胞形成并分泌各類炎癥性細胞因子，炎癥介質反過來進一步刺激脂肪組織細胞因子以旁分泌的方式產生。PCOS患者血清中及卵泡液中炎癥細胞因子水平均可見顯著增加，一方面可能存在炎癥因子通過血清-顆粒細胞屏障自循環中滲透進入，但更重要的是我們發現PCOS患者中卵巢顆粒細胞各類炎癥介質的基因表達顯著增加，可能是由于血循環中增多的炎癥細胞包括單核細胞、巨噬細胞等在卵巢組織、卵泡內局部浸潤增加［11］，顆粒細胞局部炎癥介質基因表達升高，合成過程增加。PCOS的高雄激素血癥增加單核細胞等炎癥細胞對血糖的敏感性，促進單核細胞的激活過程，促進卵泡液微環境中單核細胞生成釋放亞急性炎癥因子TNF-α及IL-6。而局部TNF-α增高可能促進卵巢顆粒細胞增生，促進卵巢卵泡膜細胞的雄激素生產，進一步形成循環圈不斷激發亞急性炎癥反應過程。各類細胞因子形成關聯的網絡交互作用，某一特定細胞因子的作用效果也許并不單純與其絕對濃度相關。該因子自身效果與誘導其它因子表達形成平衡狀態。

載脂蛋白主要在肝臟合成，運載脂類物質及穩定脂蛋白結構。卵泡液中ApoB濃度代表卵泡液中LDL成分多少，是對血循環中潛在的高脂蛋白血癥的反映。另一方面，卵泡在最終成熟過程中，各類類固醇激素的合成及變化顯著，膽固醇是激素合成的重要底物，也是卵子成熟并卵裂過程所需細胞膜性結構的重要物質。有報道稱，載脂蛋白與膽固醇結合可能對保護卵子質量及后續胚胎發育潛能有益，降低胚胎碎片［12］。成熟卵泡液中的顆粒細胞也可能存在從血清中主動攝取載脂蛋白的過程。

綜上所述，PCOS患者卵泡液內所含高水平載脂蛋白A是卵泡液內高脂蛋白狀態的直接反映。循環中的高脂血癥及亞急性炎癥各類指標可以通過血清-卵泡液屏障滲透進入卵泡液微環境，而顆粒細胞局部同樣也可能同時存在主動攝取(如ApoB)抑或是自主生成增加(如炎癥因子IL-1、IL-6及TNF-α等)等多種方式進行卵泡液局部微環境的穩態調節。卵子及后續胚胎對于自身卵泡液微環境改變易感，該生理性微環境的脂質代謝紊亂、炎癥細胞浸潤、高雄激素血癥等均可能影響到卵母細胞和胚胎的正常發育。

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(責任編輯:林白霜，羅森)

Subacute inflammatory reaction in follicular fluid of Chinese PCOS patients

YANG Xing，HUANG Rui，LIANG Xiao-yan
(Reproductive Medicine Centre，The Sixth Affiliated Hospital，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510610，China.E-mail: lxyzy@263.net)

［ABSTRACT］AIM: To retrospectively analyze the lipid metabolism disturbance and subacute inflammation within the microenvironment of follicular fluid between Chinese polycystic ovarian syndrome (PCOS) patients and the controls.METHODS: Serum lipid indexes，steroid hormone levels，and inflammatory cell counts were analyzed.The inflammatory cytokine and apolipoprotein levels were detected in the serum and follicular fluid.The mRNA expression of apolipoproteins and cytokines in the granulose cells was determined by real-time PCR.RESULTS: PCOS patients showed typical obesity accompanied with hyperlipidemia and hyperandrogenemia.Significantly elevated inflammatory cell number and cytokine levels were detected in both serum and follicular fluid.The mRNA expression levels of the inflammatory cytokines and apolipoproteins in the granulose cells from the PCOS patients were higher than those from the controls.CONCLUSION: Elevated apolipoproteins reflect systematic hyperlipidemia in the follicular fluid.Serum lipids and cytokines penetrate follicle-serum barrier and get into follicle fluid.Meanwhile，increased intake of apolipoproteins or elevated synthesis of cytokines (IL-1，IL-6 and TNF-α) by granulose cells could also be crucial to stabilize microenvironment of follicular fluid.Oocyte and subsequent embryos are sensitive to the originaal follicular environment.The lipid metabolism disturbance，inflammatory cell infiltration and hyperandrogenemia may possibly disturb oocyte developmental potential.

［KEY WORDS］Polycystic ovarian syndrome; Obese; Subacute inflammatory reaction; Follicular fluid

通訊作者△Tel: 020-38048013; E-mail: lxyzy@263.net

*［基金項目］國家自然科學基金資助項目(No.81100401; No.81470063) ;廣東省自然科學基金資助項目(No.2014A030313129)

［收稿日期］2015-06-01

［文章編號］1000-4718(2015)09-1652-05

［中圖分類號］R363

［文獻標志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.09.022