重組乳酸乳球菌的異常毒性評價

曲曉軍 王金英 夏海華等

摘要

[目的]評價重組乳酸乳球菌的異常毒性，為其制備黏膜免疫活載體疫苗及免疫型微生態制劑提供理論支持。[方法]給小白鼠腹腔注射不同劑量的表達金黃色葡萄球菌纖黏蛋白原凝集素A（ClfA）的重組乳酸乳球菌MG1363/pMG36cclfA菌液，評價重組乳酸乳球菌的異常毒性。[結果]注射高、中、低劑量重組乳酸乳球菌液的各組小白鼠7d內無一死亡，體重增長正常。[結論]重組乳酸乳球菌對機體未見異常毒性，適合制備黏膜免疫基因工程活載體疫苗和免疫型微生態制劑。

關鍵詞重組乳酸乳球菌；異常毒性；腹腔注射

中圖分類號S188文獻標識碼

A文章編號0517-6611（2015）28-022-02

Abstract[Objective]TheaimwastoevaluateabnormaltoxicityofrecombinantLactococcuslactis.，andprovidetheoreticalsupportforitsapplicationinthemucosalimmunevaccineandimmunemicroecologicalpreparation.[Method]ThemicewereintraperitoneallyinjectedwithdifferentdosesofrecombinantLactococcuslactisMG1363/pMG36cclfAstrainwithexpressingfibrinogenlectinAofStaphylococcusaureustoevaluateitsabnormaltoxicity.[Result]Theresultsshowedthat，injectionofhigh，mediumandlowdoserecombinantLactococcuslactisfluidofmicewithin7d，increasedweightwasnormalwithoutadeath.[Conclusion]RecombinantLactococcuslactishadnoabnormaltoxicitytotheorganismanditwassuitableforthepreparationofmucosalimmunegeneengineeringlivevectorvaccineandimmunemicroecologicalpreparation.

KeywordsRecombinantLactococcuslactis；Abnormaltoxicity；Intraperitonealinjection

乳酸菌是一大類可發酵碳水化合物產生乳酸的革蘭氏陽性細菌，其對人體和動物無致病性，被公認為是安全級別的有益微生物 [1]。研究表明，乳酸菌具有提升機體免疫能力、抑制腫瘤、抑制腸道中致病菌生長、預防和治療各類腹瀉以及合成維生素等功效 [2-7]。

乳酸菌包括乳酸球菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌、腸球菌等二十幾個屬 [8]。乳酸乳球菌（Lactococcuslactis）屬于乳酸菌的典型菌種，是其模式菌 [9]，為兼性厭氧的革蘭氏陽性球菌，是乳品發酵工業的重要菌株，在醫藥工程及食品領域具有非常重要的應用前景 [10]。乳酸乳球菌可耐受胃腸道低pH、蛋白酶及高膽鹽等惡劣條件，在人體內存活2～3d，其不攻擊腸道黏膜，不會引起機體較強的免疫反應 [11]。近年來，隨著基因工程和分子生物學技術的飛速發展，乳酸乳球菌分子生物學及作用機制方面的研究也取得了重要進展，乳酸乳球菌完整基因組已經完成了測序工作 [8]，這為乳酸乳球菌基因工程技術的發展和表達系統的構建奠定了重要基礎。因此，一系列基因表達載體和受體系統也相繼建立起來 [12]，以乳酸乳球菌為載體表達外源蛋白已成為生物制藥和疫苗研究的熱點 [13]。

金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）是一類重要的條件致病菌，能引起人體表皮感染、化膿性關節炎、心內膜炎等 [14-15]，美國每年因被金黃色葡萄球菌感染而喪生的人數已超過死于艾滋病人數 [16]。同時，金黃色葡萄球菌也是國內外最常見的細菌性食物中毒病原之一，由其引起的食物中毒占細菌性食物中毒的33% [17-18]。在畜禽感染方面，金黃色葡萄球菌可引起奶牛乳房炎、豬羊皮炎和流產、羔羊敗血病、馬創傷性感染、膿腫、蜂窩織炎、雞的壞疽性皮炎、敗血病等疾病，造成了巨大的經濟損失 [19]。

金黃色葡萄球菌對機體的感染首先需要黏附到宿主組織表面，然后釋放出各種毒素及酶，對機體造成傷害。而實現黏附目的的組分位于金黃色葡萄球菌表面，稱之為黏附素（adhesin）。黏附素是一類蛋白質，包括纖黏蛋白原凝集素A、B（FibrinogenbindingproteinsclumpingfactorAandB，ClfA，CIfB）、纖黏蛋白A、B（fibronectinbindingproteinsAandB，FnBPA，FnBPB）、膠原結合蛋白（collagenbindingprotein，Can）和A蛋白（proteinA）等 [20]。ClfA是金黃色葡萄球菌重要的黏附素之一，編碼ClfA的基因clfA，在迄今為止所有臨床分離的金黃色葡萄球菌中都存在，因此，以黏附素ClfA為靶位進行疫苗研制是預防和治療金黃色葡萄球菌感染的有效選擇 [19]。

筆者以評價前期構建的表達金黃色葡萄球菌黏附素ClfA的重組乳酸乳球菌MG1363/pMG36c-clfA菌株的異常毒性為目的，為下一步制備基因工程黏膜免疫活載體疫苗、新型免疫型微生態制劑奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗動物。ICR系清潔級小白鼠，雌性，18～22g，購自黑龍江省中醫藥大學實驗動物中心，共計40只，分為4組，每組10只。

1.1.2菌株。重組乳酸乳球菌（MG1363/pMG36cclfA）由黑龍江省科學院微生物研究所應用醫學微生物研究室構建。

1.1.3培養基。MRS肉湯培養基，購自廣東環凱微生物科技有限公司。

1.1.4主要儀器設備。獨立送風隔離籠具，超凈工作臺，細菌麥氏比濁儀，恒溫培養箱。

1.2方法

1.2.1重組乳酸乳球菌增菌培養。將重組乳酸乳球菌（MG1363/pMG36cclfA）接種于MRS肉湯培養基中，30℃靜止培養28h。

1.2.2重組乳酸乳球菌標準濃度菌液制備。將重組乳酸乳球菌培養物4℃、4000r/min離心20min，收集沉淀，用100ml0.9%氯化鈉注射液洗滌3次，沉淀溶于50ml0.9%氯化鈉注射液中，用細菌麥氏比濁儀精確校正菌液濃度4.0×10 4、2.0×10 7、1.0×10 8CFU/ml（以0.9%氯化鈉注射液為標準空白溶液）。

1.2.3異常毒性試驗。隨機將40只小鼠分為4組，即對照組、高劑量組、中劑量組、低劑量組，每組10只，每只小鼠試驗前編號、標記、稱重。高劑量組給1.0×10 8CFU/ml重組乳酸乳球菌氯化鈉混懸液0.5ml，中劑量組給2.0×10 7CFU/ml重組乳酸乳球菌氯化鈉混懸液0.5ml，低劑量組給4.0×10 4CFU/ml重組乳酸乳球菌氯化鈉混懸液0.5ml，對照組給0.9%氯化鈉注射液0.5ml，全部試驗組均一次性腹腔注射給藥，觀察給藥后0～7d小鼠的存活及健康情況，7d后試驗結束，每只小鼠稱重，記錄結果。

1.3數據處理

試驗數據用簡明統計軟件計算，以平均值±標準差表示。

2結果與分析

小鼠腹腔注射給藥后，對照組及高、中、低劑量組小鼠全部健存，皮膚、毛色和活動均無異常反應，7d后，每只小鼠體重均較給藥前增加，高、中、低劑量組小鼠體重增加量和增加率與對照組小鼠相比無顯著性差異（表1）。

3討論

疫苗以技術水平劃分，可分為第一代完整病原體疫苗（減毒的活疫苗及滅活疫苗）、第二代分子技術亞單位疫苗和第三代基因工程疫苗 [19]。部分第一代、第二代疫苗免疫效果不明顯，且在激發機體免疫反應之前有降解的可能性，使其應用受到了限制 [21-24]。目前，第三代基因工程疫苗是疫苗研發中的重點，而黏膜免疫活載體疫苗作為基因工程疫苗中非常重要的一類，由于其可在黏膜表面接種激發作為機體第一道屏障的黏膜免疫以阻止病原微生物的入侵，故成為基因工程疫苗研發中的熱點 [25]。

目前活載體疫苗研究最多的是致弱病原菌載體，如分枝桿菌（mycobacteria） [26]、沙門氏菌（salmonlla） [27]。但因其仍可能保持侵襲性和毒性，對兒童、老人及部分免疫缺陷者有潛在的危險，此外，過強的免疫應答會降低后繼疫苗的效力，因此，其在應用上受到了限制。

利用乳酸乳球菌作為抗原遞呈載體能夠克服上述缺陷。乳酸乳球菌是安全級的微生物，在基因工程活載體疫苗的研發上具有很多天然的優勢：首先，它不是人和動物腸道內固有菌，不會在腸道內定居，免疫原性小，不會造成免疫麻痹，可重復免疫；其次，乳酸乳球菌自身攜帶多種成分可參與免疫修飾，可作為佐劑激活機體的免疫系統，激發體液及細胞免疫；第三，乳酸乳球菌分泌蛋白較少，且不分泌胞外蛋白酶，因此，表達的外源蛋白易于純化且能保持天然的活性；最后，乳酸乳球菌易于馴化，相關表達系統的構建技術比較成熟 [28]。

該研究對前期構建的表達金黃色葡萄球菌纖黏蛋白原凝集素A（ClfA）的重組乳酸乳球菌MG1363/pMG36c-clfA菌株進行異常毒性的評價研究。該研究設置了高、中、低劑量組，分別腹腔注射1.0×10 8、2.0×10 7、4.0×10 4CFU/ml重組乳酸乳球菌氯化鈉混懸液0.5ml，相當于人體每天建議用量的2500、500和1倍。結果表明，重組乳酸乳球菌MG1363/pMG36c-clfA菌株對動物體無明顯可見的異常毒性作用。重組乳酸乳球菌在制備基因工程活載體疫苗和新型免疫型微生態制劑方面具有十分廣闊的應用前景。

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