雞傳染性貧血病毒衣殼蛋白的原核表達及鑒定

余樹培　夏文龍　胡成等

摘要[目的] 用大腸桿菌表達出CIAV的衣殼蛋白（VP1）作為免疫抗原，以建立雞傳染性貧血病毒（CIAV）的血清學診斷方法。[方法] 根據已發表的CIAV的衣殼蛋白（VP1）序列，結合Protean軟件預測出抗原富集區域，設計并合成1對引物，利用PCR擴增該區域基因，將擴增成功的VP1基因片段經T4連接酶連接至PGEX6P1表達載體。連接成功的重組質粒轉化不同的大腸桿菌表達菌株，通過IPTG誘導進行原核表達，篩選出表達量最高的菌株及最佳誘導時間和IPTG誘導濃度。以感染CIAV的雞陽性血清為一抗，對重組蛋白GSTVP1進行Westernblot分析。[結果] 成功獲得了重組質粒PGEXVP1，誘導表達后經SDSPAGE和Westernblot分析，分子量約71 kD的融合蛋白GSTVP1在大腸桿菌Rosseta中以包涵體形式大量表達，并能與雞傳染性貧血病毒陽性血清發生反應。[結論] 該研究可為抗CIAV單克隆抗體的制備及血清學診斷方法的建立等研究奠定基礎。

關鍵詞雞傳染性貧血病毒；VP1蛋白；原核表達

中圖分類號S858.31文獻標識碼

A文章編號0517-6611（2015）28-118-04

Prokaryotic Expression and Identification of Capsid Protein of Chicken Infectious Anemia Virus

YU Shupei1，2， XIA Wenlong1，2， HU CHeng1，2， CHENG Darong1，2* et al （1.College of Veterinary Medicine， Yangzhou University， Yangzhou， Jiangsu 225009；2.Jiangsu Coinnovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses，Yangzhou， Jiangsu 225009）

Abstract [Objective] The research aimed to use capsid protein （VP1） of chicken infectious anemia virus （CIAV） expressed by Escherichia coli as immunizing antigen and establish the serological diagnosis method of CIAV. [Method] According to the published VP1 sequence of CIAV， the antigenenriched regions were predicted by using Protean software. A pair of primers were designed and synthesized for the amplification of targeted VP1 genes by PCR. The amplified fragment of VP1 genes was connected to PGEX6P1 expression vector by T4 DNA ligase. The recombinant plasmid after correct connection was used to transform different strains of Escherichia coli for prokaryotic expression by IPTG inducement. The strain with the highest expression amount was screened out， and the best inducement time and the best inducement concentration of IPTG were confirmed. The positive serum o chicken infected with CIAV was used as primary antibody to conduct Westernblotting on recombinant protein GSTVP1. [Result] The recombinant plasmid PGEXVP1 was successfully obtained and verified by SDSPAGE and Western blot. The fusion protein GSTVP1 with the molecular weight of about 71 kD was abundantly expressed in Rosseta of E. coli in the form of inclusion body. And the recombinant protein could react with positive serum of chicken infectious anemia virus. [Conclusion]The research could lay the foundation for preparing antiCIAV monoclonal antibody and establishing the serological diagnosis method of CIAV.

Key words Chicken infectious anemia virus； VP1 protein； Prokaryotic expression

雞貧血病毒（Chicken infectious anemia virus，CIAV）是雞傳染性貧血?。–hicken infectious anemia，CIA）的病原，該病毒能夠造成雞的造血器官和淋巴組織受損，出現再生障礙性貧血、全身淋巴組織萎縮和免疫抑制，是雞的主要免疫抑制性疾病病原之一。1979年由日本學者Yuasa等[1]首次報道該病毒，我國于1992年由崔現蘭[2]等首次分離到，在印度、韓國等國家也陸續發現該病[3]。由于該病毒宿主范圍窄，只感染雞和火雞[4]，并且對成年雞一般不引起明顯的臨床癥狀，因此并未引起廣大養殖戶和臨床獸醫的重視。但是，CIAV感染雛雞后往往引發嚴重的免疫抑制，導致各種繼發性感染和生產能力下降，因此有必要建立特異性的分子生物學檢測方法，在雞群早期進行CIAV的監測。

CIAV基因組為單股環狀DNA，全長2.3 kb左右，共含有3個開放讀碼框，分別編碼 VP1、VP2和 VP3蛋白。VP1蛋白是CIAV 的衣殼蛋白，在刺激機體產生抗體方面起著重要作用，是主要的免疫原蛋白[5]；VP2 作為輔助蛋白，能幫助 VP1 形成正確的構象。Koch等[6]研究發現VP1只有與VP2共同表達時，才可以刺激機體產生中和抗體，二者相互協調才能誘導機體產生免疫保護作用，VP3蛋白主要作用是誘導細胞凋亡。其中，VP1蛋白是刺激機體產生抗體的主要靶位點，因此選擇制備VP1的重組蛋白來作為免疫抗原。VP1蛋白由449個氨基酸構成，大小約為51.6 kD，因為分子量不大。國外學者Pallister[7]將完整的VP1以谷胱甘肽轉移酶（GST）融合蛋白的形式在大腸桿菌進行了表達，然而經SDSPAGE電泳分析表達量極低，無法滿足高低度抗體的制備。因此，筆者利用Protean軟件對VP1全長進行分析，選擇抗原表位較為豐富的區域進行表達。

筆者以實驗室分離到的CIAV基因組為模板，經PCR擴增出VP1基因中抗原表位較集中的片段，長度為1 164 kb，克隆至pMD18T載體并測序正確后，酶切回收小片段并經T4連接酶連至PGEX6P1表達載體中，連接成功的PGEXVP1質粒轉化不同的大腸桿菌表達菌株，利用IPTG誘導進行原核表達，篩選出表達量最高的菌株以及最佳誘導時間和IPTG誘導濃度。最后，以感染CIAV的雞陽性血清為一抗，對重組蛋白GSTVP1進行Westernblot分析，以期為CIAV單克隆抗體的制備以及血清學診斷方法的建立提供候選抗原。

1材料與方法

1.1試驗材料

CIAV毒株由揚州大學獸醫學院實驗室分離保存；表達載體PGEX6P1、感受態細胞DH5α、大腸桿菌BL21、BL21（DE3）、BL21（DE3）pLysS和BL21（DE3）Rosseta菌株由揚州大學獸醫學院實驗室保存；Taq DNA聚合酶、DNA Marker DL2000、DL5000，購自寶生物工程（大連）有限公司；EcoRI、SalI限制性內切酶、T4 DNA Ligase均為Thermo公司產品；預染蛋白Marker購自上海生工生物工程有限公司；HRP標記的兔抗雞IgG購自Sigma公司。其他均為國產分析純試劑。

1.2試驗方法

1.2.1引物的設計合成與VP1片段的擴增。

根據GenBank中發表的CIAV標準毒株Cux1序列，針對VP1基因的抗原富集區域設計擴增引物，引物序列見表1，并在上下游引物的5端分別引入EcoRI和SalI酶切位點（下劃線部分）。引物交由上海生工生物工程有限公司合成。

按照常規方法提取CIAV的基因組DNA作為模板，進行PCR反應，PCR反應條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，共30個循環；72 ℃ 10 min；4 ℃保溫。PCR產物用0.1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.2克隆載體pMDVP1的構建和鑒定。

擴增后的VP1基因片段切膠回收后，與pMD18T載體連接，連接產物轉化DH5α感受態細胞。然后，挑取單菌落搖菌提質粒，使用EcoRI、SalI雙酶切鑒定，同時將陽性克隆送至上海生工生物工程有限公司進行測序。

1.2.3重組質粒PGEXVP1的構建及酶切鑒定。

重組質粒pMD18VP1用EcoRI和SalI雙酶切后回收小片段，表達載體PGEX6P1經相同酶雙酶切后回收，在T4 DNA連接酶的作用下過夜連接，連接產物轉化DH5α感受態細胞，挑取陽性重組菌落命名為PGEXVP1，并利用EcoRI和SalI對重組質粒進行雙酶切鑒定。

1.2.4重組蛋白表達菌株的篩選。

將PGEXVP1質粒分別轉化BL21、BL21（DE3）、BL21（DE3）pLysS和BL21（DE3）Rosseta菌株中，挑取單菌落后接種于5 ml含氨芐抗生素的LB培養液中，37 ℃振蕩培養至對數期生長（OD600=0.7），加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，37 ℃誘導培養6 h，將菌液離心收集后用PBS緩沖液重懸，超聲波裂解菌體，進行SDSPAGE電泳分析。

1.2.5重組蛋白GSTVP1表達條件的優化及可溶性檢測。

篩選出最合適的表達菌株后，將誘導表達的蛋白進行超聲波裂解，收集裂解上清和沉淀，觀察目的蛋白是可溶性表達還是以包涵體形式表達；隨后取OD值為0.7的重組菌在不同誘導時間、不同IPTG濃度下進行表達，摸索最佳表達條件。

1.2.6融合蛋白GSTVP1的Western blot分析。

將重組蛋白樣品經SDSPAGE電泳后轉移到硝酸纖維素膜（NC）上，在37 ℃條件下用5%（w/v）脫脂奶粉封閉1 h，然后轉入經封閉液1∶1 000稀釋的雞抗CIAV的陽性血清中，37 ℃孵育1 h，PBST洗滌后再轉入經PBS緩沖液1∶5 000稀釋的HRP標記的兔抗雞IgG中，37 ℃孵育1 h，最后用 ECL法進行顯色。

2結果與分析

2.1VP1基因片段的擴增

以制備的CIAV基因組為模板，進行PCR擴增，獲得了預期大?。? 164 bp）的特異性目的條帶（圖1）。

2.5融合蛋白表達條件的優化

為了獲得重組蛋白的最佳誘導條件，將誘導時間和誘導劑IPTG濃度設置了梯度進行最佳條件的摸索。經過SDSPAGE分析，當誘導時間過夜（圖6）、IPTG濃度1.0 mmol/L（圖7）時，即可得到最佳表達量。

3討論

雞傳染性貧血在國內發生較晚，CIAV由崔現蘭等[2]于1992年首次分離到，并且由于臨床病變不明顯、致死率較低，并未引起養殖戶及臨床獸醫的重視。然而，CIAV除了引發造血功能障礙，作為一種免疫抑制性病毒，同傳染性法氏囊病毒（IBDV）、白血病病毒（ALV）等一樣，能夠造成免疫功能減弱，降低雞群對多種傳染病的抵抗力，引發較大的經濟損失。因此，有必要建立分子生物學的檢測方法，在雞群早期進行CIAV的監測。CIAV是一種無囊膜病毒，其抗原特異性取決于顆粒表面的衣克蛋白，衣殼蛋白（VP1蛋白）作為CIAV的主要結構蛋白，在刺激機體產生免疫反應以及CIAV的抗原、抗體檢測方面有著重要作用[8]，因此可以利用該蛋白作為抗原來免疫小鼠獲得針對CIAV的特異性的抗體，以此抗體為基礎來建立ELISA試劑盒、膠體金試紙條等分子生物學檢測工具。

作為目前較為成熟的表達系統，大腸桿菌的原核表達具有制備工藝方便、產量高、經濟成本低等優點，但是VP1蛋白的N端氨基酸中富含精氨酸及其他大腸桿菌的稀有密碼子，并且有多個兩兩相連靠在一起的精氨酸序列，這為該蛋白在大腸桿菌中的表達造成了一定困難。針對此情況，許多學者刪除了N端的氨基酸[9]、對VP1進行了截短表達。國外有學者通過密碼子優化重新設計了VP1蛋白的基因，以提高蛋白表達量[10]。此外，國內也有人使用畢赤酵母完成了真核表達[11]，這些手段相對而言較為繁瑣，并且根據這些文獻描述，將VP1基因截短表達后，單獨的N端或C端蛋白經Westernblot檢驗不能與CIAV陽性雞血清發生反應，可能對其生物活性造成了影響。筆者表達了VP1的第1～388位氨基酸多肽，最大限度地保留了VP1蛋白的全長，同時為了去除N端稀有密碼子的影響，采用大腸桿菌Rosetta作為表達菌，該菌株通過一個相容性氯霉素抗性質粒補充了稀有密碼子的tRNAs，可以增強帶有大腸桿菌稀有密碼子的真核蛋白的表達。SDSPAGE結果亦證實GSTVP1融合蛋白在Rosetta菌株中的

表達量比在BL21、BL21（DE3）、DE3pLysS等菌株中高。

該試驗所表達的GSTVP1融合蛋白以包涵體的形式存在，這可能是由于融合蛋白在大腸桿菌中表達時，缺乏適當的加工與修飾，翻譯完成后不能完全折疊成天然構象分泌出細胞外，但是經過Westernblot檢測可以與臨床上采集的CIAV病例的血清反應，因此可以作為檢測抗原進行CIAV的血清學診斷。GSTVP1蛋白在大腸桿菌中的成功表達為CIAV的單克隆抗體的制備、基于VP1重組抗原的CIAV間接ELISA診斷方法等分子生物學研究提供了基礎材料，為今后CIAV的診斷、監測及疫苗的研制奠定了基礎。

參考文獻

[1]

YUASA N，TANIGUCHI T，YOSHIDA I. Isolation and characteristics of an agent inducing anemia in chicks[J]. Avian Dis，1979，23：366-385.

[2] CUI X L，XIN G X，WU D L，et al.Identification of chicken infectious anemia virus[J].Chin Anim Poult Infec Dis，1992，6：3-5.

[3] KIM H R，KWON Y K，BAE Y C，et al.Molecular characterization of chicken infectious anemia virus detected from breeder and broiler chickens in South Korea[J].Poult Sci，2010，89（11）：2426-2431.

[4] SOMMER F，CARDONA C.Anemia virus in broilers：Dynamics of the infection in two commercial broiler flocks[J].Avian Dis，2003 ，47（4）：1466-1473.

[5] KAFFASHI A，NOORMOHAMMADI A H，ALLOTT M L.Browning GF viral load in 1dayold and 6weekold chickens infected with chicken anaemia virus by the intraocular route[J].Avian Pathol，2006，35（6）：471-475.

[6] KOCH G，VAN ROOZELAR D J，VERSCHUEREN C A J，et al.Immunogenic and protective properties of chicken anaemia virus proteins expressed by baculovirus[J].Vaccine，1995，13：763-770.

[7] PALLISTER J，FAHEY K J，SHEPPARD M.Cloning and sequencing of the chicken anemia virus（CAV） ORF 3 gene ，and the development of an ELISA for the detection of serum antibody to CAV[J].Vet Microbiol，1994，39（1/2）：167-178.

[8] LIEN Y Y，HUANG C H，SUN F C，et al.Development and characterization of a potential diagnostic monoclonal antibody against capsid protein VP1 of the chicken anemia virus[J].Veterinary science，2012，13（1）：73-79.

[9] WANG Y，WANG X M，GAO H L，et al.Cloning and expression of the gene encoding chicken infectious anemia virus VP1 Cterminal in E.coli[J].Chin Prev Vet Med，2004，26：432-435.

[10] LEE M S，HSEU Y C，LAI G H，et al.High yield expression in a recombinant E.coli of a codon optimized chicken anemia virus capsid protein VP1 useful for vaccine development[J].Microbial cell factories，2011，10：56.

[11] 林歡，高宏雷，王笑梅，等.雞貧血病毒VP1 和VP2基因在畢赤酵母中的表達及產物免疫學特性的初步研究[J].中國預防獸醫學報，2008，30（7）：496-499.