頭孢菌素合成酶無載體固定化工藝研究

【摘 要】本實驗對頭孢菌素合成酶無載體固定化工藝進行研究。本實驗對頭孢菌素合成酶交聯(lián)聚集體制備的固定化溫度、固定化時間、固定化PH進行考察。最佳制備條件為固定化溫度為5攝氏度、固定化時間90分鐘、固定化PH為7.頭孢菌素合成酶轉(zhuǎn)化試驗轉(zhuǎn)化收率為73.2%。

【關(guān)鍵詞】頭孢菌素；合成；研究

頭孢菌素類是由冠頭孢菌培養(yǎng)液中分離的頭孢菌素C，經(jīng)改造側(cè)鏈而得到的一系列半合成抗生素。頭孢菌素具有抗菌譜廣、引起的過敏反應(yīng)較青霉素類低、對厭氧菌有高效、對酸及對各種細菌產(chǎn)生的β-內(nèi)酰胺酶較穩(wěn)定等優(yōu)點。頭孢菌素類由于其不良反應(yīng)和毒副作用較低，是當前開發(fā)較快的一類抗生素。本實驗對頭孢菌素合成酶無載體固定化工藝進行研究。

1.儀器與試劑

PHscan30型酸度計（蘇州江東精密儀器有限公司）；PILOT VAP 10-50大型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（北京賽美思儀器設(shè)備有限公司）；KHW-D-1LC精密拉伸水浴鍋（上海科恒實業(yè)發(fā)展有限公司）；scientz98-III杯式超聲波粉碎機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；LC-15C高效液相色譜儀（成都安恒達科技有限公司）；YOKO-2005雙波長薄層色譜掃儀（武漢藥科新技術(shù)開發(fā)有限公司）；TGL20MW臺式大容量高速冷凍離心機（湖南赫西離心機儀器有限公司）；QT3120K脫氣可調(diào)型超聲波清洗器（天津市瑞普電子儀器公司）；奧豪斯Explorer專業(yè)型分析天平（奧豪斯儀器上海有限公司）；XYG-H帕恩特痕量分析級超純水機（北京湘順源科技有限公司）。聚乙二醇（貴州隴盛達生物科技有限公司）、戊二醛（湖北巨勝科技有限公司）、苯甘氨酸甲酯（上海瀚鴻化工科技有限公司）。

2.實驗

2.1頭孢菌素合成酶交聯(lián)聚集體制備條件比較試驗

2.1.1固定化溫度的影響

分別取酶上清液200毫升，加入30克聚乙二醇溶解，再加入3克戊二醛，分別在5攝氏度、10攝氏度、15攝氏度、20攝氏度、25攝氏度、30攝氏度下反應(yīng)120分鐘，過濾，洗滌，檢測交聯(lián)酶聚集體活性。當反應(yīng)溫度為5攝氏度時固定化收率為百分之七十九點三；當反應(yīng)溫度為10攝氏度時固定化收率為百分之七十六點三；當反應(yīng)溫度為15攝氏度時固定化收率為百分之七十一點二；當反應(yīng)溫度為20攝氏度時固定化收率為百分之六十八點三；當反應(yīng)溫度為25攝氏度時固定化收率為百分之六十六點五；當反應(yīng)溫度為30攝氏度時固定化收率為百分之六十二點一。實驗結(jié)果表明隨著溫度的升高，固定化收率降低，所以采用5攝氏度為反應(yīng)溫度。

2.1.2固定化時間的影響

分別取酶上清液200毫升， 加入30克聚乙二醇溶解，再加入3克戊二醛，在5攝氏度分別采用30分鐘、60分鐘、90分鐘、120分鐘、150分為反應(yīng)時間進行實驗，過濾，洗滌，檢測交聯(lián)酶聚集體活性。采用30分鐘反應(yīng)時間時固定化收率為百分之八十三點五，聚集體顆粒大小不合格；采用60分鐘反應(yīng)時間時固定化收率為百分之七十九點一，聚集體顆粒大小部分合格；采用90分鐘反應(yīng)時間時固定化收率為百分之七十二點一，聚集體顆粒大小合格；采用120分鐘反應(yīng)時間時固定化收率為百分之六十一點六，聚集體顆粒大小合格；采用150分鐘反應(yīng)時間時固定化收率為百分之四十二點三，聚集體顆粒大小合格。實驗結(jié)果表明反應(yīng)時間為90分鐘實驗效果最好，所以選擇90分鐘為反應(yīng)時間。

2.1.3固定化PH的影響

分別取酶上清液200毫升，分別調(diào)PH值為4、5、6、7、8、9、10， 加入30克聚乙二醇溶解，再加入3克戊二醛，在5攝氏度反應(yīng)90分鐘，過濾，洗滌，檢測交聯(lián)酶聚集體活性。當反應(yīng)PH值為4時固定化收率為百分之三十三點五；當反應(yīng)PH值為5時固定化收率為百分之五十點二；當反應(yīng)PH值為6時固定化收率為百分之六十三點三；當反應(yīng)PH值為7時固定化收率為百分之七十九點五；當反應(yīng)PH值為8時固定化收率為百分之六十三點二；當反應(yīng)PH值為9時固定化收率為百分之四十二點六；當反應(yīng)PH值為10時固定化收率為百分之二十九點五。實驗結(jié)果表明反應(yīng)PH值為7實驗效果最好，所以7為反應(yīng)PH值。

2.2頭孢克洛酶轉(zhuǎn)化試驗

采用苯甘氨酸甲酯與7-氨基-3氯代頭孢烷酸比例為2.5：1，PH值為6，反應(yīng)溫度為三十攝氏度，無載體固定化酶使用量為5U/ml進行頭孢菌素合成酶轉(zhuǎn)化試驗。固定化酶成功的得到了頭孢克洛產(chǎn)品，轉(zhuǎn)化收率為73.2%。

3.討論

頭孢克洛屬第二代口服頭孢菌素，對多種革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均具有很強的殺滅作用[1-5]。頭孢克洛為廣譜半合成頭孢菌素類抗生素。頭孢克洛對產(chǎn)青霉素酶金黃色葡萄球菌、A組溶血性鏈球菌、草綠色鏈球菌、對不產(chǎn)酶金黃色葡萄球菌和肺炎球菌具有抗菌作用[6-9]。頭孢克洛常用于咽喉炎、扁桃體炎、支氣管炎、肺炎等由肺炎雙球菌、流感嗜血桿菌、化膿性鏈球菌、麥粒腫、牙周組織炎、牙冠周圍炎、腭炎、猩紅熱等[10-11]。目前頭孢克洛的合成為化學(xué)合成。頭孢克洛的酶法合成工藝取代化學(xué)合成工藝是其工業(yè)生產(chǎn)的必然趨勢。本實驗對頭孢克洛合成酶交聯(lián)聚集體制備的固定化溫度、固定化時間、固定化PH進行考察。最佳制備條件為固定化溫度為5攝氏度、固定化時間90分鐘、固定化PH為7.頭孢菌素合成酶轉(zhuǎn)化試驗轉(zhuǎn)化收率為73.2%。 [科]

【參考文獻】

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