錦鯉皰疹病毒—CJ株ORF108基因的克隆及生物信息學分析

摘要：為研究我國錦鯉皰疹病毒的基因背景信息，從錦鯉皰疹病毒中國吉林株（KHV-CJ株）獲得ORF108基因，應用生物信息學方法分析KHV-CJ株ORF108基因結(jié)構(gòu)和功能。結(jié)果顯示，ORF108基因長588bp，為一完整的開放閱讀框，編碼196個氨基酸，理論分子質(zhì)量為21207.37Da。KHV-CJ株與美國株（KHV-U）的ORF108基因的序列一致性為99%，在第564位的堿基A突變?yōu)镚。但該突變位置編碼的氨基酸并沒有發(fā)生改變，同為絲氨酸。ORF108基因編碼蛋白的1-61位氨基酸位于細胞膜表面，62-84位氨基酸之間形成一個典型的跨膜螺旋區(qū)。該蛋白的表面抗原決定簇位點區(qū)域廣泛、峰值高，預示該基因可作為基因工程疫苗的重要候選基因。

關(guān)鍵詞：錦鯉皰疹病毒;ORF108基因;生物信息學分析

基金項目：長春市科學技術(shù)局先進實用技術(shù)的示范推廣項目（12XN35）

中圖分類號： S941.41 " " " " " " " " " " " " " " " 文獻標識碼： "A " " " " " " " " DOI編號： " 10.14025/j.cnki.jlny.2015.22.043

自從20世紀90年代末，錦鯉皰疹病毒病（Kioherpesvirusdisease，KHVD）就在普通鯉魚和觀賞錦鯉上發(fā)現(xiàn)并報道[1-2]。感染本病毒后病魚聚集在進水口，身體出現(xiàn)白色斑塊，皮膚呈現(xiàn)砂紙狀紋理并變得粗糙。病魚出現(xiàn)鰓和眼睛凹陷壞死等癥狀。

引起本病的病原較早稱錦鯉皰疹病毒（Kio herpesvirus，KHV）。有人根據(jù)其病理變化又稱為鯉腎炎鰓壞死病毒。2012年ICTV（國際病毒命名委員會）發(fā)布的第九次分類報告將本病毒命名為鯉皰疹病毒3型（Cyprinid herpesvirus 3，CyHV-3）。本病毒隸屬于皰疹病毒目（Herpesvirales）異樣皰疹病毒科（Alloherpesviridae）鯉皰疹病毒屬（Cyprinivirus）成員。相關(guān)文獻一般仍沿用錦鯉皰疹病毒這個名字。

鯉皰疹病毒屬內(nèi)還有鯉皰疹病毒Ⅰ型和鯉皰疹病毒Ⅱ型兩種病毒。錦鯉皰疹病毒具有雙鏈DNA基因組，是魚類皰疹病毒屬中基因組最大的病毒[3]，長達295kbp，有156個開放閱讀框[4]。基因裝在20面立體結(jié)構(gòu)的核衣殼內(nèi)，外面包裹來源于宿主的囊膜，囊膜上鑲嵌病毒表達的糖蛋白。截至目前，病毒的基因有40個結(jié)構(gòu)蛋白被鑒定。包括3個衣殼蛋白，13個囊膜蛋白，2個被膜蛋白以及22個未分類蛋白[5]。

感染本病毒初期魚體內(nèi)各組織均有病毒分布，然后病毒在幾個組織和外周白細胞中持續(xù)感染，使得普通鯉魚和錦鯉造成潛伏性感染[6]。當魚在裝載、運輸?shù)拳h(huán)境壓力下，潛伏的病毒能被激活重新復制進入到細胞外面去，造成排毒并發(fā)病[7-8]。因此頻繁的異地運輸和貿(mào)易使得本病快速的傳播[9]。錦鯉皰疹病毒病無論在人工養(yǎng)殖的普通鯉魚和錦鯉中還是在自然水域中都普遍存在。本病死亡率最高可達100%，嚴重影響觀賞錦鯉的全球貿(mào)易和鯉魚養(yǎng)殖。鑒于錦鯉皰疹病毒病的嚴重性，聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織和世界動物衛(wèi)生組織都將其列入到了水產(chǎn)養(yǎng)殖和食品資源安全威脅列表和必須呈報的疾病名單中[10]。

鯉魚針對錦鯉皰疹病毒的免疫應答包括先天性免疫和適應性免疫。致病結(jié)果很大程度上應答是有利于病毒所采用的逃避策略還是宿主的免疫應答，理解這兩個相反的過程可以幫助開發(fā)疫苗或治療，采用合適的手段來控制本病。

錦鯉皰疹病毒病死亡率高，除預防接種外尚無有效的治療方法[11]。對于病毒與機體的相互作用，機體對本病毒的應答機理也未明確。Michael Gotesman等針對TK基因和DNA聚合酶基因（TP）設(shè)計siRNA片段在體外進行實驗，結(jié)果能有效減少病毒顆粒從CCB的釋放[12]。

本研究以錦鯉皰疹病毒吉林株（KHV-CJ株）基因組為模板，利用PCR技術(shù)獲得KHV膜蛋白ORF108基因，分析基因的生物學信息，目的是為我國錦鯉皰疹病毒的基因背景信息、分子流行病學及基因工程疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 毒株與試劑

KHV吉林株及錦鯉尾鰭原代細胞（KF-1）由本實驗室保存[13]。

新生牛血清、L-15培養(yǎng)基;ExTaqDNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶EcoRⅤ和EcoRⅠ、10×ExBuffer、dNTPMix、DNAMarker、DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒。

1.2 引物的設(shè)計及合成

依據(jù)GenBank上登錄的KHV全基因組序列（GenBank：DQ657948.1）的ORF108基因序列，利用引物設(shè)計軟件Primer Premiers 5.0設(shè)計引物如下：

ORF108P1：5'-GATATCATGGACACCAACTATACCAAC-3';

ORF108P2：5'-GAATTCTTACGATACAAAGGACTCGTC-3';

引物兩端加EcoRⅤ和EcoRⅠ限制性酶切位點（劃線部位）。

1.3 KHV-CJ株ORF108基因的PCR擴增

取1毫升KHV-CJ株病毒液與尾鰭原代細胞在22℃的條件下共培養(yǎng)。收集病毒并提取病毒DNA作為PCR模版，采用25μL反應體系進行PCR，循環(huán)溫度和時間如下：95℃預變性5分鐘;35個循環(huán)：94℃熱變形1分鐘、退火59.6℃ 30秒、延伸72℃ 1分鐘;后延伸72℃ 10分鐘。PCR產(chǎn)物低溫保存。

1.4 KHV-CJ株ORF108基因的克隆及鑒定

回收PCR產(chǎn)物，克隆入pMD18-T載體，用EcoRⅤ和EcoRⅠ進行雙酶切鑒定。篩選出的陽性質(zhì)粒送至公司測序。

1.5 KHV-CJ株ORF108基因編碼蛋白的生物信息學分析

將測序結(jié)果在GenBank中進行BLAST比對，利用軟件DNAStar6.0翻譯出ORF108基因的氨基酸序列;利用TMHMM Server v.2.0軟件進行跨膜區(qū)分析;利用ProtScale軟件分析蛋白質(zhì)的疏水性;利用BepiPred1.0 Server軟件和DNAStar6.0（Protean）對ORF108序列編碼的蛋白進行抗原表位分析。

2 結(jié)果

2.1 ORF108基因的PCR擴增和鑒定

PCR擴增出一條約600bpDNA片段。將PCR產(chǎn)物回收，連接pMD 18-T載體，篩選的陽性重組質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶EcoRⅤ和EcoRⅠ進行雙酶切鑒定（見圖1），在588bp處和大于2000bp處各有一條帶，說明目的基因克隆至pMD 18-T載體。測序結(jié)果表明：本實驗室分離株與美國株同源性均為99%，表明通過PCR獲得了KHV-CJ株的ORF108基因。

M：DL2000DNA Markers; 2： pMD18T-108的雙酶切產(chǎn)物。

2.2 KHV-CJ株ORF108基因的生物信息學分析

2.2.1 測序結(jié)果的BLAST比對 將測序堿基序列在GenBank中進行核酸BLAST比對，鯉皰疹病毒3型中國吉林株（KHV-CJ）ORF108基因與美國株（KHV-U）的ORF108基因的序列一致性為99%，在第564位的堿基A突變?yōu)镚。但該突變位置編碼的氨基酸并沒有發(fā)生改變，同為絲氨酸。

2.2.2 基因的序列和編碼蛋白分子特征 ORF108基因長588bp，為一完整的開放閱讀框，編碼196個氨基酸，理論分子質(zhì)量為21207.37Da，等電點為5.947，含有15個堿性氨基酸（K、R ）、18個酸性氨基酸（D、E）、77個疏水性氨基酸（A、I、L、F、W、V）和54個極性氨基酸（N、C、Q、S、T、Y）。

2.2.3 跨膜區(qū)分析 TMHMM預測（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）結(jié)果顯示ORF108基因編碼蛋白的1-61位氨基酸位于細胞膜表面，62-84位氨基酸之間形成一個典型的跨膜螺旋區(qū)（圖2）。85-195位于細胞膜內(nèi)部。

圖2鯉皰疹病毒3型中國吉林株（KHV-CJ）ORF108的跨膜區(qū)分析序列的TMHMM預測后概率

2.2.4 疏水性分析 ProtScale在線分析（http：//web.expasy.org/

protscale/）表明（Hphob. / Kyte amp; Doolittle算法），ORF108基因編碼蛋白具有一定的疏水性，ORF108最大疏水指數(shù)為3.256，最小疏水指數(shù)為-2.244。進入ProtParam工具（http：//web.expasy.org/protparam/），ORF108的總平均疏水值為0.127，其疏水區(qū)域大于親水區(qū)域，可判斷為蛋白疏水性蛋白。

2.2.5 抗原表位分析 "利用http：//www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred/在線軟件和DNAStar 6.0（Protean）對錦鯉皰疹病毒ORF108序列編碼的蛋白進行抗原表位分析，ORF108抗原表位主要集中在第12～17、99～104、117～120、161～168和187～192位氨基酸（圖3），表明蛋白的表面抗原決定簇主要位于這些區(qū)域，預示這些抗原表位可能與該病毒的免疫原性有關(guān)。

圖3鯉皰疹病毒3型中國吉林株（KHV-CJ）ORF108基因的抗原表位分析

3 討論

針對錦鯉皰疹病毒ORF108基因編碼的蛋白進行抗原表位分析，顯示出該蛋白的表面抗原決定簇相對集中于后半段，峰值高。囊膜蛋白位于病毒的最外面，由于其曝露于血液當中常產(chǎn)較多的特異性抗體，因此可作為檢測的特異性抗原。漿細胞產(chǎn)生的抗體通常僅僅識別一個抗原決定簇，而一個抗原決定簇僅有5～8個氨基酸組成，因此利用原核表達蛋白上的部分抗原決定簇可用來檢測陽性抗體，也可以將其免疫動物制備抗體來檢測病原。ORF108基因的分析提示其可以用來制備作為檢測錦鯉皰疹病毒的備用基因。正確而詳細地繪制蛋白質(zhì)表位圖譜，對定點改造蛋白質(zhì)分子，設(shè)計疫苗分子結(jié)構(gòu)及免疫干預治療等具有重要意義。

KHV ORF108基因產(chǎn)物為囊膜蛋白[5]。通常囊膜蛋白與病毒的感染甚至病毒的毒力相關(guān)。對于囊膜病毒而言，通過其囊膜糖蛋白（Envelope glycoprotein）介導的病毒囊膜和宿主細胞膜的融合而啟動病毒的侵染。囊膜病毒表面的蛋白與宿主細胞的受體結(jié)合后，引起了病毒融合蛋白構(gòu)象發(fā)生變化，引起宿主通過胞吞導，病毒進入細胞導致病毒感染細胞。根據(jù)病毒的囊膜蛋白構(gòu)象變化方式，可將囊膜病毒分為兩類：Ⅰ型病毒膜融合和Ⅱ型病毒膜融合。Ⅱ型病毒膜分子機制不是很清楚。Ⅰ型病毒膜融合過程中，囊膜蛋白形成折疊的發(fā)夾三聚體結(jié)構(gòu)時，縮短了細胞膜和病毒囊膜的距離，這一過程會釋放能量，能量更促進膜融合。ORF108基因產(chǎn)物為Ⅰ型囊膜蛋白，分子大小約21kDa，質(zhì)譜測試完全匹配上的肽段序列17.3%，protein score得分87。以上述理論研究為基礎(chǔ)設(shè)計的C肽/N肽小分子抑制子，有可能通過結(jié)合囊膜與病毒受體產(chǎn)生競爭或者與囊膜蛋白結(jié)合后影響了蛋白的折疊使兩膜之間的距離不能靠近從而阻止Ⅰ型囊膜蛋白的融合機制。這就為病毒疾病的防治提供了新思路和策略。

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作者簡介：王好，博士，吉林農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，講師，研究方向：動物病原學。