兩種檢測(cè)乙型肝炎病毒DNA定量方法的比較與評(píng)價(jià)

摘要：目的 評(píng)價(jià)兩種檢測(cè)乙型肝炎病毒（HBV）DNA方法的特點(diǎn)。方法 用美國DIGENE公司生產(chǎn)的Hybrid Capture-II HBV DNA試劑（HC-II）和深圳匹基生物工程股份有限公司生產(chǎn)的HBV DNA定量熒光PCR檢測(cè)試劑（PG），定量檢測(cè)HBsAg陽性的慢性乙肝患者血清中的HBV DNA。結(jié)果 HC-II試劑的HBV DNA 檢測(cè)陽性率達(dá)98.6%，PG試劑達(dá)到94.6%，兩者的符合率為93.2%。用系列稀釋的患者血清，測(cè)定兩種定量檢測(cè)方法的靈敏度，PG試劑略高于GC-II試劑。HC-II在HBV DNA濃度較高時(shí)的定量關(guān)系精度較好，而在HBV DNA低滴度時(shí)，兩者的定量誤差均加大。用兩種方法檢測(cè)HBV DNA 定量監(jiān)測(cè)抗病毒藥物治療慢性乙型肝炎的療效，所測(cè)定的HBV DNA 滴度呈相同變化趨勢(shì)。結(jié)論 兩種HBV DNA 定量檢測(cè)方法均較高的靈敏度，在抗病毒藥物療效觀察方面有較高的應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞：肝炎病毒；乙型；脫氧核糖核酸；定量檢測(cè)

乙型肝炎病毒（HBV）DNA 是反映HBV復(fù)制的最直接、最可靠的指標(biāo)，在評(píng)價(jià)治療乙型肝炎藥物的療效與預(yù)后判定方面，HBV DNA 的檢測(cè)具有至關(guān)重要的作用。檢測(cè)HBV DNA 的方法有很多種。斑點(diǎn)雜交和聚合酶鏈反應(yīng)方法（PCR）是常用方法，但兩者均不能進(jìn)行定量檢測(cè)，因此其臨床應(yīng)用價(jià)值有限。近幾年發(fā)展起來的定量核酸檢測(cè)方法可以對(duì)病毒核酸進(jìn)行相對(duì)的定量檢測(cè)，對(duì)于藥物治療效果的評(píng)價(jià)和病毒復(fù)制活性的判定很有意義。目前為止，定量檢測(cè)HBV DNA 的方法很多，但還沒有統(tǒng)一的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，各種方法之間難以進(jìn)行橫向比較。本研究采用美國DIGENG公司生產(chǎn)的HBV DNA 檢測(cè)試劑盒HC-II和深圳匹基生物工程股份有限公司生產(chǎn)的HBV DNA 熒光定量檢測(cè)試劑盒，對(duì)74份HBV表面抗原（HBsAg）陽性血清進(jìn)行HBV DNA 的定量檢測(cè)，并對(duì)兩種方法的特點(diǎn)進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 資料與方法

1.1一般資料 慢性乙型肝炎患者血清46份，均符合2000年西安會(huì)議修訂的病毒性肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.2取已知HBV DNA 強(qiáng)陽性的血清1份，以10小牛血清按10倍梯度系列稀釋，獲得系列稀釋血清為：10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7。用兩種方法分別測(cè)定HBV DNA 滴度，以確定兩種方法的靈敏度。

1.3 HBsAg、乙型肝炎e抗原和抗乙型肝炎的檢測(cè)：用ORGANN TEKNIKA Reader2305酶標(biāo)儀進(jìn)行HBsAg、乙型肝炎e抗原（HBeAg）和抗乙型肝炎e抗原（抗- HBe）常規(guī)檢測(cè)（HBsAg試劑為荷蘭阿克蘇公司產(chǎn)品。HBeAg和抗HBe試劑為意大利澳斯邦公司產(chǎn)品）。

1.4 HC-方法 美國DIGENE公司生產(chǎn)的第二代基因雜交信號(hào)放大系統(tǒng)（ HC-II），先將預(yù)先制備的DNA-RNA雜交體特異性抗體包被在標(biāo)準(zhǔn)酶聯(lián)吸附試驗(yàn)（ ELISA ）板上，再將血清中待測(cè)的靶DNA變性解鏈，加入與靶 DNA互補(bǔ)的RNA探針.復(fù)性后， RNA探針與靶DNA互補(bǔ)結(jié)合為 DNA-RNA雜交體。將DNA-RNA雜交體加入ELISA板上，則包被的特異性抗體捕獲雜交體。加入堿性磷酸酶標(biāo)記的第二抗體，每個(gè)DNA-RNA雜交體均可結(jié)合多個(gè)酶標(biāo)記的第二抗體，從而使信號(hào)得到放大。加入底物后，堿性磷酸酶可催化底物并發(fā)出淡黃色熒光，用靈敏的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器檢測(cè)熒光強(qiáng)度，根據(jù)熒光的有無和強(qiáng)弱判斷靶 DNA的有無和含量。

1.5實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)熒光PCR檢測(cè) 所用儀器為Roche公司LigtCyclerTM，HVB DNA定量熒光PCR檢測(cè)試劑為深圳匹基生物工程股份有限公司（簡(jiǎn)稱PG）產(chǎn)品。其檢測(cè)原理如下：在該P(yáng)CR反應(yīng)體系中，除一對(duì)引物外，還有一條能與PCR產(chǎn)物雜交的雙熒光標(biāo)記探針，在該探針的兩端分別標(biāo)記有熒光信號(hào)基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)。熒光信號(hào)基團(tuán)發(fā)出的熒光信號(hào)可被鄰近的熒光淬滅基團(tuán)揚(yáng)吸收而不能測(cè)出。如果該探針被切斷，則信號(hào)基團(tuán)發(fā)出的熒光信號(hào)可被儀器接收。在PCR反應(yīng)開始后，PCR引物和熒光標(biāo)記探針均與待測(cè)的靶基因互補(bǔ)結(jié)合，在Taq酶的催化下，開始鏈延伸。因Taq酶兼具有外切本科酶活性，因此當(dāng)新合成的DNA鏈延伸至熒光探針處時(shí)，則將熒光探針切斷，釋放出熒光信號(hào)基團(tuán)，所發(fā)出熒光可被儀器接收。被釋放的熒光基團(tuán)數(shù)量與PCR產(chǎn)物數(shù)量成一定比例關(guān)系，因此，測(cè)定熒光信號(hào)的強(qiáng)弱，可推算出PCR產(chǎn)物的拷貝數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 HBV DNA 檢測(cè)結(jié)果比較 見表1。在74份標(biāo)本中。兩種方法共同測(cè)定陽性69份，共同測(cè)定陰性0份，符合93.2。

2.2定量曲線 從原濃度血清到10-3稀釋度之間，HC-II方法表現(xiàn)出非常好的定量梯度曲線，定量精度很高，直線回歸方程的斜率等于1；從原濃度血清到10-4稀釋度時(shí)，其直線回歸方程的斜率也達(dá)到0.954。在10-4以上的稀釋度，定量梯度曲線變得逐漸平坦，斜率約0.71。PG試劑在HBV DNA高濃度時(shí)的線性關(guān)系不如HG-II試劑，斜率約0.6。但其測(cè)定值的數(shù)量范圍較寬，因此在DNA低濃度時(shí)仍能保持相當(dāng)好的線性關(guān)系。

2.3 HBeAg/抗-HBe與HBV DNA定量檢測(cè)結(jié)果的關(guān)系：根據(jù)HBeAg/-HBe檢測(cè)結(jié)果，將患者分為三組，其對(duì)應(yīng)的HBV DNA定量結(jié)果見表2。

2.4 HBV DNA的測(cè)定單位 兩種方法的測(cè)定單位均為\"拷貝/ml\"，但兩者的測(cè)定絕對(duì)值相差較多，HC-II的測(cè)定值比PG試劑約高1.65log10。由于目前沒有統(tǒng)一的測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)，因此不能判定哪一種方法的測(cè)定值更準(zhǔn)確。

3 討論

目前定量檢測(cè)HBV DNA的方法有多種。HC-II的主要特點(diǎn)是，檢測(cè)過程中不進(jìn)行PCR擴(kuò)增，南昌是使用分子雜交、抗體捕獲的方法，因此穩(wěn)定性和重復(fù)性好。此外，HC-II在雜交時(shí)用的是HVB DNA全基因分子探針，因此結(jié)合牢固，即使有部分基因發(fā)生突變也不影響分子雜交，從而提高了陽性檢出率。深圳PG公司用的實(shí)時(shí)熒光PCR法，靈敏度很高，定量關(guān)系也較好。本研究檢測(cè)的74份血清，HC-IIP的陽性率為98.6%，PG試劑為94.6%，兩者的符合率為93.2%.HC-II試劑的檢出范圍為1.4×105～1.7×109拷貝/ml，PG試劑的檢出范圍為8.6×102～1.5×108拷貝/ml。同一份標(biāo)本兩種不同的方法檢測(cè)，HC-II的測(cè)定值大于PG試劑約為1.65log10。需要說明的是，兩者的檢測(cè)單位名稱雖然相同，但沒有可比性和等量關(guān)系，從上述兩種檢測(cè)方法的檢測(cè)范圍，不能說明兩種方法何者實(shí)際檢測(cè)范圍寬或檢測(cè)靈敏度高。

以10倍梯度稀釋的乙型肝炎患者血清考查兩種檢測(cè)方法的靈敏度，HC-II方法可測(cè)到10-6水平，PG試劑可測(cè)到10-7水平，但兩者的測(cè)定值在10以后線性關(guān)系較差，曲線變得平坦。從稀釋曲線看，HC-II的線性關(guān)系尤其是從原濃度血清至10-4段，直線的擬合度極佳，優(yōu)于PG試劑。在高稀釋度時(shí)，兩者的定量關(guān)系均不太理想，因此低濃度的HBV DNA在定量測(cè)定時(shí)可能誤差會(huì)增大。

我們觀察4例患者治療前后的系列血清，兩種HBV DNA定量方法測(cè)定的結(jié)果呈相同變化趨勢(shì)，兩條曲線吻合較好。表明兩種HBV DNA宣定量的方法均可很好地監(jiān)測(cè)抗病毒治療的效果。此外，兩種方法檢測(cè)時(shí)間均較短，一般4h左右即可完成全部檢測(cè)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Ho SK， Chan TC，Cheng IK， et al. Comparison of the second-generation Digene hybrid capture assay with the Brached-DNA assay for measurement of hepatitis B virus DNA in serum[J]. J Clin Microbiol ，1999，37：2461-2465.

[2]Chan HL， Leung NW， Lau TC， et al. Comparison of three different sensitive assays for hepatitis B virus DNA in monitoring of responses to antiviral therapy[J]. J Clin Microbiol， 2000， 38：3205-3208 編輯/哈濤