促紅細胞生成素與甲基強的松龍對星形膠質細胞的作用研究

郝彥明，王洪震 ，賈正平 ，徐又佳，俞 晨

（1.江蘇省昆山市第一人民醫(yī)院關節(jié)科，江蘇 蘇州 215300； 2.蘇州大學附屬第二醫(yī)院骨科，江蘇 蘇州 215004）

目前，甲基強的松龍（MPSS）是臨床治療急性神經損傷相對有效的藥物，對損傷早期有一定效果，但不良反應大、后期效果不佳。因此，對于現(xiàn)階段交通事故及墜落傷導致的高發(fā)疾病神經損傷，迫切需要其他藥物以得到更好的救治效果。我科研組通過動物大體研究發(fā)現(xiàn)，促紅細胞生成素（EPO）對神經系統(tǒng)損傷有明顯療效，其他學者同樣發(fā)現(xiàn)EPO用于神經損傷早期及后期均能顯著降低繼發(fā)性炎性反應及改善預后等。若將兩者聯(lián)合應用，是否會得到更理想的效果，且以原代細胞為載體研究兩者聯(lián)合應用對神經細胞的作用目前尚未見報道。為此，筆者將MPSS與EPO聯(lián)用對星形膠質細胞（AST）的作用進行了研究，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

器械及儀器：眼科鑷，精細刀片，200目濾網，小燒杯，離心管，離心機；37℃恒溫搖床，超凈工作臺，倒置顯微鏡，勻漿機，高速低溫離心機，分光光度儀，聚合酶鏈式反應（PCR）儀，F(xiàn)R-200型紫外與可見光分析裝置。

試藥與動物：DMEM／F12培養(yǎng)基（Gibco公司）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；胰蛋白酶，多聚賴氨酸（Sigma公司）；膠質纖維酸性蛋白（GFAP）熒光抗體（Sigma公司）；甲基強的松龍（MPSS，Pfizer Manufacturing Belgium NV公司，批號為H20080285）；促紅細胞生成素（EPO，日本麒麟啤酒株式會社高崎醫(yī)藥工廠，進口藥品注冊證號J20060040）；磷酸鹽緩沖液（PBS，自行配制）。新生SD大鼠（蘇州大學動物中心提供，動物合格證號SCXK2008-0005）；GFAP引物、β-actin引物（生工生物工程＜上海＞股份有限公司）；PCR試劑（Promega公司）。

1.2 方法

星形膠質細胞原代培養(yǎng)：將新生3 d內的SD大鼠靜脈血釋放、處死，取出大腦（盡量完整），在預冷的PBS中剝離腦膜，并以PBS沖洗3遍（去血細胞及雜質），將大腦切碎，吹打均勻，以1 000 r／min的轉速離心10 min，取上清液，再次吹打均勻，10 min后過濾，按1.5×107計數(shù)接種于培養(yǎng)瓶（需提前1 d用0.01%多聚賴氨酸包被），置培養(yǎng)箱（5%CO2，95%O2，37 ℃ ）中培養(yǎng)，3 d 后換液，8 ～10 d 細胞可分裂增殖滿瓶壁，放于搖床（200 r／min，18 h）去除少突膠質細胞和小膠質細胞，換液培養(yǎng)1 d后傳代，即得到純度較高的星形膠質細胞，取培養(yǎng)至第3代、第4代的細胞進行試驗。

分組及處理：將試驗用細胞分為8組，分別進行如下處理。正常對照組（A1組）細胞傳代后培養(yǎng)2 d，棄去培養(yǎng)基，更換新培養(yǎng)基培養(yǎng)；正常細胞+MPSS組（A2組）細胞傳代后培養(yǎng)2 d，更換培養(yǎng)基，按 10 μmol／L 將 MPSS 加入并于新的培養(yǎng)基培養(yǎng)［1］；正常細胞+EPO組（A3組）細胞傳代后培養(yǎng)2 d，更換培養(yǎng)基，按10 U／L將EPO加入并于新的培養(yǎng)基培養(yǎng)［2］；正常細胞+MPSS+EPO組（A4組）細胞傳代后培養(yǎng)2 d，更換培養(yǎng)基，將 MPSS（10 μmol／L）與 EPO（10 U ／L）加入并于新的培養(yǎng)基培養(yǎng)；損傷組（B1組）細胞傳代后培養(yǎng)2 d，以PBS代替培養(yǎng)基培養(yǎng)3 h，再換新的培養(yǎng)基培養(yǎng)；損傷細胞+MPSS組（B2組）細胞傳代后培養(yǎng)2 d，以PBS 代替培養(yǎng)基培養(yǎng) 3 h，將 MPSS（10 μmol／L）加入并于新的培養(yǎng)基培養(yǎng)；損傷細胞+EPO組（B3組）細胞傳代后培養(yǎng)2 d，以PBS代替培養(yǎng)基培養(yǎng)3 h，將EPO（10 U／L）加入并于新的培養(yǎng)基培養(yǎng)；損傷細胞+MPSS+EPO組（B4組）細胞傳代后培養(yǎng)2 d，以PBS代替培養(yǎng)基培養(yǎng) 3 h，將 MPSS（10 μmol／L）與 EPO（10 U ／L）加入并于新的培養(yǎng)基培養(yǎng)。

星形膠質細胞鑒定：以GFAP鑒定，采用免疫熒光染色并鑒定。免疫熒光顯微鏡觀察可見較明顯的細胞形態(tài)，待星形膠質細胞培養(yǎng)至第3代，細胞爬片3 d后用PBS洗3次（5 min）后，按熒光染色說明書染色、觀察并攝像。

MTT法檢測細胞活性：將傳代至第3代的細胞吹打均勻后，按照1×106／孔種植于96孔板，待細胞完全貼壁，按照上述分組分別制造試驗模型；培養(yǎng)3 d后每孔加入MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，然后每孔加二甲基亞砜（DMSO）150 μL，振動器振蕩10 min；在酶聯(lián)免疫檢測儀上選用490 nm波長測定各孔吸光度值，記錄結果。

PCR法檢測GFAP的表達變化：將上述分組（共8組）細胞分別收集1×106，按PCR儀說明書操作步驟完成。GFAP和β-actin引物序列和擴增產物大小見表1。將各組電泳條帶通過Smartview-2001生物電泳圖象分析軟件進行吸光度分析，可得到試驗組與對照組各時間點GFAP mRNA的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，各組樣本均數(shù)間比較行t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 倒置顯微鏡下高純度的星形膠質細胞

通過去纖維、血細胞、雜質，搖床，分離傳代方式培養(yǎng)方法，可得到高純度（純度超過95%）的星形膠質細胞，待傳代至第3代，細胞突觸明顯變長，相互間交織成網狀，細胞純化度高，基本未見其他雜細胞（見圖1 A）。缺營養(yǎng)3 h后細胞形態(tài)已發(fā)生較明顯變化，如大部分細胞胞體變小，突觸變短，細胞間相互連接減少或消失，部分甚至呈空泡樣，個別細胞萎縮至呈圓形（見圖1 B）。

圖1 星形膠質細胞倒置顯微鏡圖

2.2 熒光免疫化學染色結果

因GFAP為星形膠質細胞的特異性蛋白，GFAP染色可使星形膠質細胞呈陽性，可清晰顯示正常星形膠質細胞：胞體多數(shù)為三角形，胞膜光滑，邊界清楚，突觸長并多數(shù)相互連接；DAPI熒光染色可清晰顯示細胞核，多為藍色圓形，GFAP陽性細胞占總細胞數(shù)的比例在95%以上（見圖2）。

圖2 星形膠質細胞熒光免疫化學染色圖

2.3 MPSS與EPO對星形膠質細胞活性的影響

結果見表2和表3。可見，B1組與A1組細胞活性有顯著性差異（P＜0.05），故該細胞損傷模型制作成功；MPSS與EPO聯(lián)用及兩者單用對缺營養(yǎng)損傷后細胞活性有顯著性影響（P＜0.05），單用MPSS、單用EPO與缺營養(yǎng)損傷后的細胞活性有顯著性差異（P＜0.05），但單用MPSS與單用EPO組間細胞活性則無顯著性差異（P＞0.05）；MPSS與EPO聯(lián)用及兩者單用對正常細胞活性無顯著性影響（P＞0.05），單用MPSS與單用EPO組間細胞活性也無顯著性差異（P＞0.05）。

表2 各組細胞活性測定結果（吸光度值，MTT法）

表3 各組細胞活性測定結果比較

2.4 MPSS與EPO對星形膠質細胞GFAP表達的影響

結果見表4、表5及圖3。可見，各組細胞 GFAP mRNA表達水平比較，B1組與A1組有顯著性差異（P＜0.05），故該細胞損傷模型制作成功；B4組比 B1組、B2組、B3組明顯升高，B2組、B3組比B1組也明顯升高，而B2組與B3組間則無明顯差異；A4組比A1組、A2組及A3組均無明顯差異；A2組、A3組比A1組及A2組比A3組間也無明顯差異。

表4 各組細胞GFAP mRNA表達水平測定結果（相對表達量，PCR法）

表5 各組細胞GFAP mRNA表達水平比較

圖3 各組細胞GFAP mRNA及βactin的電泳條帶

3 討論

原代神經細胞培養(yǎng)難度大，且細胞純化難度大，本研究中利用星形膠質細胞在0.01%多聚賴氨酸包被過的培養(yǎng)皿貼附能力大于其他神經細胞的原理純化得到星形膠質細胞，通過反復吹打洗滌可去除血細胞；腦膜表面的纖維細胞要得到良好去除，必須完整剝離腦膜，故選擇乳鼠，迅速完整取出大腦，在PBS內適當浸泡后腦膜與腦實質可較容易分離。試驗細胞純度鑒定采用GFAP。GFAP為特有細胞骨架蛋白，可作為星形膠質細胞生理和病理情況下的特異性分子標志，且可根據(jù)其表達評價細胞的損傷程度。已有研究發(fā)現(xiàn)，在維持星形膠質細胞的形態(tài)結構及功能中，GFAP擔任重要作用，若阻滯GFAP的表達，細胞的生長、增殖均受到嚴重 影響 。Farooque 等［3］與 O′Brein 等［4］報道 ，在 急 性 脊 髓 損 傷（ASCI）模型大鼠可觀測到星形膠質細胞體積變大，GFAP含量明顯增加。

糖皮質激素對神經系統(tǒng)的作用已有較多研究，但其對GFAP表達及合成的影響研究相對較少。O′Callaghan等［5］發(fā)現(xiàn)，糖皮質激素能抑制未損傷大鼠腦組織海馬區(qū)內GFAP的合成，卻不能影響損傷后GFAP合成的增加。EPO對神經系統(tǒng)的作用為目前研究的熱點，鑒于神經細胞損傷后除糖皮質激素大量沖擊治療暫無明顯有效的藥物，但大量糖皮質激素應用后會產生嚴重不良反應，故許多學者開始研究新的藥物或聯(lián)合應用的效果。Villa等［2］通過動物模型研究證明，外源性的重組人促紅細胞生成素（rhEPO）能有效地通過血腦屏障，并能提供神經保護。俞歐［6］認為，rhEPO不僅能糾正腎性貧血，還具有改善細胞營養(yǎng)狀態(tài)和抗炎作用，局部缺血可產生致炎因子、腫瘤壞死因子、白細胞介素-6，應用rhEPO后炎性因子及腫瘤壞死因子可減少50%以上。Sirén等［7］研究發(fā)現(xiàn)，EPO和EPO受體在損傷8～48 h的神經細胞和血管內皮細胞的表達水平明顯增加；且在損傷后12～24 h EPO受體上調，到損傷后8 d EPO免疫反應性減少，但顯示為EPO陽性的神經元數(shù)目未發(fā)生變化，并在損傷周圍區(qū)大量血管顯示強EPO受體陽性，而在星形膠質細胞中可見中度的EPO和EPO受體免疫反應性表達；損傷后14 d，雖然血管內皮細胞和神經細胞的EPO免疫反應性極弱，但EPO受體陽性仍持續(xù)不變。上述研究可證明，在神經細胞及組織中不僅有EPO及EPO受體表達，且在損傷后表達可明顯改變，為EPO應用于損傷神經細胞能夠產生藥物作用提供了理論依據(jù)。

EPO與MPSS聯(lián)合應用于神經細胞已有學者進行了研究，但存在不少爭議，這為進一步的研究提供了思路及研究空間。Gorio等［8］的研究認為，EPO不可與MPSS聯(lián)用，因為MPSS有可能抑制EPO在脊髓損傷中的某些作用。Cetin等［9］的研究卻認為，EPO聯(lián)合MPSS治療神經損傷，能更好地提高神經功能恢復并改善組織病理學形態(tài)。王望曉［10］對照研究了采用MPSS與鼠神經生長因子對視神經損傷的效果。

本研究中采用的劑量 MPSS 為 10μmol／L［1］，EPO 為 10U ／L［2］，結果顯示，MPSS與EPO聯(lián)用及兩者單用對缺營養(yǎng)損傷后星形膠質細胞活性有顯著性影響，單用MPSS、單用EPO對缺營養(yǎng)損傷后細胞活性也有顯著性影響，但單用MPSS與單用EPO組間細胞活性則無顯著性差異；MPSS與EPO聯(lián)用及兩者單用對正常的星形膠質細胞活性無顯著性影響，單用MPSS與單用EPO組間細胞活性也無顯著性差異。星形膠質細胞表達或不表達或低表達MPSS受體與EPO受體，給予外源性MPSS或EPO時沒有相應的受體可結合，不能激活相應的信號通道。而損傷后的星形膠質細胞MPSS受體及EPO受體大量表達，外源性MPSS或EPO可分別與相應的受體結合，其作用途徑需進一步探討。MPSS與EPO聯(lián)用對缺營養(yǎng)損傷后的星形膠質細胞活性改善比兩者單用效果更好，進一步推想，如要得到同樣療效，聯(lián)用時兩者的劑量是否會大大減少，從而可避免兩者的嚴重不良反應，如高劑量MPSS引起的傷口感染、肺炎、敗血癥乃至死亡等呼吸系統(tǒng)并發(fā)癥，MPSS的抗炎作用可能對神經再生和軸突萌芽有不良反應，從而加重損傷后神經系統(tǒng)的缺血性壞死。

參考文獻：

［1］Schmitt KR，Kern C，Berger F，et al.Methylprednisolone attenuates hypothermia-and rewarming-induced cytotoxicity and IL-6 release in isolated primary astrocytes，neurons and BV-2 microglia cells［J］.Neuroscience Letters，2006，404（3）：309-314.

［2］Villa P，Bigini P，Mennini T，et al.Erythropoietin selectively attenuates cytokine production and inflammation in cerebral ischemia by targeting neuronal apoptosis［J］.J Exp Med，2003，198（6）：971-975.

［3］Farooque M，Badonic T，Olsson Y，et al.Astrocyte reaction after graded spinal cord compression in rats：immunohistochemical studies on glial fibrillary acidic protein and vimentin［J］.J Neurotrauma，1995，12 （1）：41-52.

［4］O′Brien MF，Lenke LG，Lou J，et al.Astrocyte response and transforming growth factor-beta localization in acute spinal cord injury［J］.Spine，1994，19 （20）：2 321-2 329.

［5］O′Callaghan JP，Brinton RE，McEwen BS.Glucocorticoids regulate the synthesis of glial fibrillary acidic protein in intact and adrenalectomized rats but do not affect its expression following brain injury［J］.J Neurochem，1991，57 （3）：860-869.

［6］俞 歐.重組人促紅細胞生成素對維持性血液透析患者營養(yǎng)狀態(tài)和微炎癥狀態(tài)的影響［J］.中國藥業(yè)，2012，21（1）：6-7.

［7］Sirén AL，Knerlich F，Poser W，et al.Erythropoietin and erythropoietin receptor in human isehemic ／hypoxic brain［J］.Acta Neuropathol，2001，101 （3）：271-276.

［8］Gorio A，Madaschi L，Di Stefano B，et al.Methylprednisolone neutralizes the beneficial effects of erythropoietin in experimental spinal cord injury［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2005，102 （45）：16 379-16 384.

［9］Cetin A，Nas K，Büyükbayram H，et al.The effects of systemically administered methylprednisolone and recombinant human erythropoietin after acute spinal cord compressive injury in rats［J］.Neurosurg Spine，2006，15（10）：1 539-1 544.

［10］王望曉.鼠神經生長因子治療視神經挫傷31例［J］.中國藥業(yè)，2013，22（11）：53-54.