反相高效液相色譜法測定去甲斑蝥素齊墩果酸復合脂質(zhì)體包封率*

方志娥 ，陳 薇 ，唐直婕 ，冷 靜

（1.重慶市中醫(yī)院，重慶 400021； 2.重慶醫(yī)科大學藥學院，重慶 400016）

去甲斑蝥素（NCTD）由馬來酐和呋喃反應后制得的人工全合成化合物，具有較強的抑制肝癌等多種癌細胞生存等作用，對泌尿系統(tǒng)、胃腸道、骨髓毒副作用低［1-2］。齊墩果酸（OA）為五環(huán)三萜類天然化合物，對肝癌細胞具有明顯的抑制作用，且呈時間和濃度依賴性［3］，還具有抗炎抗病毒等作用［4］。脂質(zhì)體是由磷脂分散在水中形成具有雙分子層的超微球狀粒子，進入體內(nèi)后主要被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)攝取，具有肝靶向性，可用于治療肝腫瘤及防止淋巴系統(tǒng)腫瘤等的擴散和轉移。本研究中采用薄膜分散法，制備去甲斑蝥素齊墩果酸復合脂質(zhì)體，并采用冷凍超速離心-梯度洗脫反相高效液相色譜（RP-HPLC）法同時測定復合脂質(zhì)體中去甲斑蝥素和齊墩果酸的包封率。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

Agilent 1260型高效液相色譜儀（配G1312C型二元泵，G1314F型紫外檢測器，G1329B型自動進樣器及Agilent Chemstation化學工作站，美國Agilent公司）；BS210S型電子分析天平（德國Sartorious公司）；KQ-3200E型超聲儀（江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠）；Thermo Micro 21／21R型冷凍超速離心機（美國Thermo公司）；LD-50G-D型超純水處理器（重慶利迪實驗儀器設備有限公司）；旋轉蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）。去甲斑蝥素對照品（批號為100414-200501）、齊墩果酸對照品（批號為110709-201206）均由中國藥品生物制品檢定所提供；去甲斑蝥素（純度98%）、齊墩果酸（純度98%）均由南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司提供；去甲斑蝥素和齊墩果酸復合脂質(zhì)體（重慶醫(yī)科大學醫(yī)學院實驗室自制，批號分別為 20130319，20130325，20130329）；大豆卵磷脂（純度99%）、膽固醇（純度99%）均由成都市科龍化工試劑廠提供；甲醇（美國Teddy公司）為色譜純，Triton X-100（上海晶純實業(yè)有限公司）和其他試劑均為分析純，試驗用水為純化水。

2 方法與結果

2.1 復合脂質(zhì)體及溶液制備

空白脂質(zhì)體：稱取卵磷脂240 mg，膽固醇80 mg，溶于二氯甲烷30 mL中，將此溶液置250 mL圓底燒瓶中，35℃水浴下旋轉蒸發(fā)形成類脂質(zhì)薄膜后，加入pH＝7.0的磷酸鹽緩沖液（PBS）15 mL，水合 2 h，超聲 20 min；過 0.45 μm 微孔濾膜，得空白脂質(zhì)體混懸液。取適量空白脂質(zhì)體混懸液，加入適量10%Triton X-100甲醇溶液破乳，過膜，測定。

含藥脂質(zhì)體：稱取卵磷脂240 mg，膽固醇80 mg，去甲斑蝥素20 mg，齊墩果酸10 mg，同空白脂質(zhì)體制備方法制得含藥脂質(zhì)體混懸液。取適量含藥脂質(zhì)體混懸液，加入適量10%Triton X-100甲醇溶液破乳，過膜，測定。

標準貯備液：準確稱取去甲斑蝥素對照品50.0 mg，用甲醇溶解并定容至50 mL容量瓶中，配制成質(zhì)量濃度為1.0 g／L的標準貯備液，保存于4℃。準確稱取齊墩果酸對照品25.0 mg，用甲醇溶解并定容至50 mL容量瓶中，配制成質(zhì)量濃度為0.5 g／L的標準貯備液，保存于4℃。

標準混合溶液：精密量取去甲斑蝥素和齊墩果酸標準貯備液適量，混合，用甲醇稀釋，依次配制成去甲斑蝥素質(zhì)量濃度為20，50，100，200，300 μg ／mL 和齊墩果酸質(zhì)量濃度為 10，25，50，100，150 μg／mL的標準混合溶液，保存于4℃。

2.2 色譜條件

色譜柱：Thermo Sycronis C18柱（150 mm ×4.6 mm，5 μm），保護柱為 Agilent Zorbax C18填料（12.5 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：A為純化水（磷酸調(diào)節(jié)pH至3.2），B為甲醇，梯度洗脫條件見表 1；檢測波長：210 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：50 μL。

表1 流動相梯度洗脫條件

2.3 方法學考察

專屬性試驗：在擬訂色譜條件下進樣測定。結果標準混合溶液、空白脂質(zhì)體和含藥脂質(zhì)體的色譜圖見圖1。可見，去甲斑蝥素約在3.7 min出峰，齊墩果酸約在8.5 min出峰，表明雜質(zhì)峰不干擾主峰，該方法專屬性強。

圖1 去甲斑蝥素和齊墩果酸脂質(zhì)體高效液相色圖譜

線性關系考察：按2.1項下方法制配去甲斑蝥素質(zhì)量濃度為20，50，100，200，300 μg ／mL 和齊墩果酸質(zhì)量濃度為 10，25，50，100，150 μg／mL的標準混合溶液，在擬訂色譜條件下測定，以質(zhì)量濃度（C，μg／mL）為橫坐標、峰面積（A）為縱坐標進行線性回歸。回歸方程去甲斑蝥素為 A ＝2.17C+5.19（r＝0.999 8，n＝5），齊墩果酸為 A ＝22.10 C-73.49（r＝0.999 7，n＝5）。結果表明，去甲斑蝥素質(zhì)量濃度在20～300 μg／mL范圍內(nèi)［檢出限為4.5 μg／mL（S ／N ＝3）］、齊墩果酸質(zhì)量濃度在 10 ～150 μg／mL 范圍內(nèi)［檢出限為 4.0 μg／mL（S／N ＝3）］與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：按2.1項下方法制配去甲斑蝥素質(zhì)量濃度為20，100，300 μg ／mL 和齊墩果酸質(zhì)量濃度為 10，50，150 μg ／mL的標準混合溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，各連續(xù)進樣5次。結果，去甲斑蝥素低、中、高3個質(zhì)量濃度的 RSD≤3.25%（n＝5），齊墩果酸低、中、高3個質(zhì)量濃度的 RSD≤3.04%（n＝5），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：按2.1項下方法制配去甲斑蝥素質(zhì)量濃度為20，100，300 μg ／mL 和齊墩果酸質(zhì)量濃度為 10，50，150 μg ／mL的標準混合溶液，于4℃保存，按擬訂色譜條件分別于1，3，5，7，12，24 h時進樣測定。結果，去甲斑蝥素低、中、高3個質(zhì)量濃度的RSD≤2.16% （n＝6），齊墩果酸低、中、高 3 個質(zhì)量濃度的RSD≤2.84%（n＝6），表明標準混合溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復性試驗：按2.1項下方法配制去甲斑蝥素質(zhì)量濃度為20，100，300 μg ／mL 和齊墩果酸質(zhì)量濃度為 10，50，150 μg ／mL的標準混合溶液各5份，按擬訂色譜條件進樣測定。結果去甲斑蝥素低、中、高3個質(zhì)量濃度的 RSD≤5.89%（n＝5），齊墩果酸低、中、高3個質(zhì)量濃度的 RSD≤4.22%（n＝5），表明方法重復性良好。

回收率試驗：取2.1項下制備的空白脂質(zhì)體，加入去甲斑蝥素和齊墩果酸標準混合溶液，制備含去甲斑蝥素質(zhì)量濃度分別為20，100，300 μg／mL 和齊墩果酸質(zhì)量濃度分別為 10，50，150 μg／mL的脂質(zhì)體。取50 μL脂質(zhì)體加入1 mL 10%Triton X-100甲醇溶液破乳。按擬訂色譜條件進樣測定，每個質(zhì)量濃度連續(xù)測定5次，計算回收率。結果見表2。

表2 去甲斑蝥素和齊墩果酸的回收試驗結果（n＝5）

2.4 脂質(zhì)體包封率測定

精密量取2.1項下3批含藥脂質(zhì)體（批號分別為20130319，20130325，20130329）溶液 1.0 mL，置冷凍超速離心機中，14 800 r／min 4℃離心95 min。取上清液按擬訂色譜條件進樣測定，計算游離藥物濃度（C游）；同時將離心前的脂質(zhì)體混懸液用10%Triton X-100甲醇溶液破乳并稀釋至適當倍數(shù)測定，計算出藥物總濃度（C總），按以下公式計算藥物包封率：包封率（%）＝（C總-C游）／C總×100%。結果脂質(zhì)體中去甲斑蝥素的平均包封率為（48.01±2.34）% （n＝5），齊墩果酸的平均包封率為（87.31 ± 0.56）% （n ＝ 5）。

3 討論

脂質(zhì)體包封率測定方法的確定：測定脂質(zhì)體包封率的常用方法有透析法［5］、葡聚糖凝膠柱色譜法［6］、魚精蛋白凝聚法［7］、離心法［8］等。透析法簡單，不需昂貴的儀器，但耗時較長。葡聚糖凝膠柱色譜法分離脂質(zhì)體和游離藥物時洗脫液對脂質(zhì)體進行了大量稀釋，可能導致脂質(zhì)體滲漏。魚精蛋白凝聚法的測定結果受脂質(zhì)體Zeta電位影響。超速離心法對離心機要求較高，但操作簡單，耗時短，可有效分離脂質(zhì)體和游離藥物。因此，選用超速離心法測定脂質(zhì)體包封率。

高效液相色譜（HPLC）法的確定：去甲斑蝥素和齊墩果酸的結構相差較大，在色譜柱中的保留行為有差異。以標準混合溶液試驗了等度和梯度2種洗脫方式。考察了流動相組成水（磷酸調(diào)節(jié) pH 至 3.2）∶甲醇（V ／V）為 65 ∶35，45 ∶55，25 ∶75，5 ∶95 時等度洗脫去甲斑蝥素和齊墩果酸的分離情況。結果表明，去甲斑蝥素和齊墩果酸色譜峰的出峰時間隨流動相中有機相含量的增加而逐漸減小，由于齊墩果酸的脂溶性較強，只有在高比例的有機相條件下出峰較快，同時去甲斑蝥素色譜峰和溶劑峰不能完全分離，故考慮使用梯度洗脫使2種物質(zhì)得到最佳分離并縮短分析時間。經(jīng)過考察，梯度洗脫條件：0～3 min，水（磷酸調(diào)節(jié)pH至3.2）∶甲醇（V ／V）為 65 ∶35，流速為 1.0 mL ／min；3 ～3.5 min，水（磷酸調(diào)節(jié) pH 至 3.2）-甲醇（V ／V）為65∶35→5∶95，流速為 1.0 mL ／min；3.5 ～4.5 min，水（磷酸調(diào)節(jié) pH 至 3.2）∶甲醇（V ／V）為 5 ∶95，流速為 1.0→1.7 mL／min；4.5 ～10 min，水（磷酸調(diào)節(jié) pH 值至 3.2）∶甲醇（V ／V）為 5 ∶95，流速為 1.7 mL ／min。此時，去甲斑蝥素和齊墩果酸得到最佳分離且分析時間大大縮短。

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