云南省豬戊型肝炎病毒全基因組擴增及進化分析

楊臣臣,龍飛燕,畢艷紅,李云龍,王 玨,禹文海,井申榮,黃 芬

云南省豬戊型肝炎病毒全基因組擴增及進化分析

楊臣臣,龍飛燕,畢艷紅,李云龍,王 玨,禹文海,井申榮,黃 芬

目的 對豬戊型肝炎病毒全長基因組進行擴增，分析其進化關系，為HEV的感染性克隆研究奠定基礎。方法 利用巢式逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-nPCR)和RACE技術對豬糞便中HEV樣品進行全基因組擴增，利用DNAStar和MEGA4.0軟件進行同源性比較和進化樹分析。結果 RT-nPCR方法擴增出HEV的 5段目的基因序列和RACE技術擴增出HEV的 5′和3′端，序列比對結果正確，HEV全長擴增成功。同源性分析顯示其與新疆株(GU119961)同源性較高(96.1%)。系統進化樹顯示該病毒屬于基因4型h亞型豬HEV。結論 HEV全基因組序列擴增成功，為深入研究HEV奠定基礎。

豬戊型肝炎病毒；巢式逆轉錄PCR；全長基因組分析

戊型肝炎病毒(hepatitis E virus, HEV)，是一種經腸道傳播，嚴重危害人類健康的病毒性肝炎病原體[1]。HEV主要經過糞-口途徑傳播，食用HEV污染的水源和食物是導致HEV暴發流行的主要原因[2-3]。戊型肝炎病毒對孕婦和胎兒危害尤為嚴重，極易造成胎兒早產、流產和死胎，妊娠晚期感染HEV后死亡率高達25%[4-7]。我國1986-1988年新疆地區HEV大流行造成20多萬人發病，死亡707人(孕婦414人)，是迄今為止世界上最大的HEV流行[8]。

根據HEV基因組全序列的差異，可以將戊型肝炎病毒不同毒株分為4個主要的基因型：基因1型、基因2型、基因3型和基因4型[9-10]。新發現的禽HEV與其他4種基因型差異較大，成為一種新的基因型，命名為禽HEV[11]。2009年Zhao等在家兔上分離到的HEV株與已知的4種HEV基因型和禽HEV同源性均較低，是一種能感染兔子的新HEV基因型[12]。而鼠HEV是在德國挪威大鼠體內分離得到[13-14]。

云南省以旅游產業為主，流動人口較大，衛生條件相對落后，至今還保留著生食豬肉的風俗，并且很多地方仍直接飲用不經消毒處理的露天生水，這增加HEV的流行暴發的可能。但是到目前為止，關于云南省HEV的分子流行調查較少，僅有2009年李文貴等對昆明地區屠宰場豬肉產品中HEV的感染情況進行過初步的調查[[15]。在2010年，我們對云南省農村豬群中HEV的流行情況進行了調查，發現在豬群中存在較高的HEV感染率(陽性率為10.26%)[[16]。本文通過選取其中一株陽性HEV樣本，進行HEV的全基因組擴增，并對其同源性和進化關系進行分析，為后續HEV研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 樣品采集與處理 豬HEV糞便樣本，采用0.1% DEPC處理的PBS緩沖液(PBS緩沖液，NaCl 137 mmol/L，KCl 2.7 mmol/L，Na2HPO410 mmol/L，KH2PO42 mmol/L，pH7.2～7.4)重懸糞便樣本，離心力12 000 g離心15 min，收集上清，-80 ℃保存。

1.2 RT-nPCR法檢測HEV RNA 利用Trizol(Invitrogen)RNA提取試劑盒提取糞便上清總RNA，并進行逆轉錄合成cDNA鏈。逆轉錄試劑采用TaKaRa公司AMV逆轉錄試劑盒，操作按試劑盒說明書進行。RT-nPCR引物序列為人和豬HEV的兼并引物，可以擴增人和豬HEV的所有序列，引物序列如表1[[17]。反應參數為：42 ℃ 30 min，95 ℃ 5 min。利用合成cDNA進行巢式PCR，擴增HEV衣殼蛋白ORF2區域部分片段(348 bp)。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶。

1.3 HEV基因序列全長擴增 利用QIAamp Viral RNA Mini Kit(QIAGEN)試劑盒提取HEV陽性樣品(27#)總RNA，利用PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2試劑盒擴增HEV的全基因組序列。全基因組序列分為5段進行擴增，F1片段大小為1 285 bp，F2片段大小為1 603 bp，F3片段大小為1 339 bp，F4片段大小為1 236 bp，F5片段大小為1 932 bp，引物序列如表1[1]。PCR反應參數為：50 ℃ 30 min，95 ℃ 3 min，95 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min。PCR循環參數：35循環。HEV 5′和3′端分別采用5′-Full RACE Kit with ATP和3′-Full RACE Core set with PrimeScriptTMRTase試劑盒進行擴增，5′和3′端片段大小分別為501 bp和936 bp，反應條件參照說明書。具體為：外套95 ℃ 3 min，95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min；PCR循環參數：20循環；72 ℃延伸10 min。內套：95 ℃ 3 min，95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min；PCR循環參數：25循環；72 ℃延伸10 min。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶。目的條帶膠回收純化后進行克隆和測序。

cPrimersequence(5′?3′)ProductLength/bpReferenceS11AGGCTCCTGGCRTYACTACTGF11285[17]A12GCGGCACTGGGCRTAAAACTHEV?A3GAAAAGTCTGGCCGTGATTACF21603ThisstudyHEV?B2TCCTCAGTAATAGTAAGGGCHEV?C3GCCAGCCATAGCTTGGTTTGAAGF31339ThisstudyD3RCTGGAAGAATGTTATACGAGACACD4FATGGTGGAGAAAGGCCAGGATF41236ThisstudyER2GAAGGGGTTGGTTGGATGAATEF1TTTCTGGGGTGACCGGGTTGATTF51932ThisstudyHEV31CAGGGAGCGCGGAACGCAGAAAAGA5′Race?A1GCAGTGARTARAGYGCAAYCCCHGTCT5′RACE501[17]5＂Race?A2CGRGCCATYGCCTCNGCRACATC3′Race?S1ACYACNACTGCTGCYACACGBTTYATGA3′RACE9363′Race?S2CTYTGTTYAAYCTTGCTGAYACGCTKCTCHEV1AATTATGCC(T)CAGTAC(T)CGG(A)GTTGHEVdetection348[16]HEV2CCCTTA(G)TCC(T)TGCTGA(C)GCATTCTCHEV3GTT(A)ATGCTT(C)TGCATA(T)CATGGCTHEV4AGCCGACGAAATCAATTCTGTC

1.4 HEV同源性和進化分析 采用SeqMan軟件對HEV的5個片段和5′和3′RACE進行拼接，HEV全基因組序列進行Blast核苷酸序列比對分析，并提交GeneBank數據庫(KJ155502)。采用DNAStar軟件和Megalign軟件對其分別進行同源性分析和系統進化分析。HEV基因型分析所采用的參照序列為：基因1型為NC001434和M80581；基因2型為M74506；基因3型為JN906975和AB089824；基因4型為GU206559。其中基因4型亞型分析采用的參照序列為：a亞型為AF117275和AJ344171；b亞型為AB124818和AJ344186；c亞型為AB082545；d亞型為AJ344181和AY596308；e亞型為AF324501；g亞型為AB108537；h亞型為JN542514和KF703731。

2 結 果

2.1 豬HEV RT-nPCR檢測 PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分析，如圖1，目的片段和理論大小348 bp相一致。PCR產物連接 pMD18-T載體，進行序列測定，Blast分析顯示該病毒屬于基因4型豬HEV。

1～5：樣品編號；6：陰性對照；M：DL2000 marker

1-5: number of samples; 6: negative control; M: DNA Marker DL2000.

圖1 RT-nested PCR產物電泳結果

Fig.1 Agarose gel electrophoresis of HEV gene fragment amplified by RT-nested PCR

2.2 豬HEV全長基因組序列擴增及分析 HEV全基因組序列分為5部分進行PCR擴增，取產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分析，5個目的片段和理論大小相一致，結果如圖2。HEV 5′和3′端擴增結果與理論大小一致，如圖3。PCR產物連接pMD18-T載體，進行序列測定，經Blast分析顯示結果正確，豬HEV全長擴增成功。HEV全基因組序列提交GenBank數據庫，序列號為KJ155502。

本實驗分離的HEV病毒株基因組全長為7 240 bp(除去Pol(A)部分)，GC含量為55%。5′端為1 bp-26 bp，開放閱讀框1(ORF1)為27 bp-5 150 bp，開放閱讀框2(ORF2)為5 147 bp-7 171 bp，開放閱讀框3(ORF3)為5 175 bp-5 519 bp，3′端為7 172 bp-7 264 bp，其ORF1和ORF2有3個堿基的重疊， ORF3與和ORF2完全重疊。

1：F1片段2：F2片段3：F3片段4：F4片段；5：F5片段；6：陰性對照；M：DL2000 marker

1: F1 fragment; 2: F2 fragment; 3: F3 fragment; 4: F4 fragment; 5: F5 fragment; 6: negative control; M: DNA Marker DL2000.

圖2 豬HEV全長基因組序列PCR擴增

Fig.2 Agarose gel electrophoresis of HEV complete sequences fragment amplified by PCR

1：5′RACE PCR；2：3′RACE PCR 3：陰性對照；M：DL2000 marker

1: 5′RACE PCR; 2: 3′RACE PCR; 3: negative control; M: DL2000 marker.

圖3 豬HEV基因組5′RACE和3′RACE PCR擴增

Fig.3 Agarose gel electrophoresis of HEV 5′RACE and 3′RACE sequences fragment amplified by PCR

2.3 豬HEV全長基因組序列同源性和系統進化分析 全長基因組同源性分析顯示，該毒株與HEV 1型、2型、3型和4型的同源性為39.1%～96.1%。與2009年分離自新疆(GU119961)、武漢(GU188851)和2011年分離自南京(JQ740781)的同源性最高分別為96.1%、95.7%和95.5%；與1993年分離自墨西哥的人HEV(M74506，基因2型)同源性最低(39.1%)，如圖4。

基于HEV ORF2部分序列(348 bp)的系統進化分析顯示，本實驗分離毒株(KJ155502)屬于基因4型h亞型豬HEV，與2011年分離自云南的豬HEV(JN613156)、2009年分離自新疆的豬HEV(GU119961)、2009年分離自武漢的豬HEV(GU188851)和2011年分離自南京的人HEV(JQ740781)親緣關系較近，如圖5。

圖4 HEV全基因組序列同源性分析(%)

圖5 HEV部分ORF2序列系統進化分析

Fig.5 Phylogenetic analysis base on HEV ORF2 partial sequence

3 討 論

豬HEV病毒是一種人獸共患病毒，豬是HEV的主要宿主，不衛生的飲食習慣和人畜相互接觸都會引起HEV的傳播感染。近幾年，在中國，基因4型HEV已經代替基因1型成為優勢基因型[21]。本實驗中分離的HEV病毒株全長核苷酸序列與基因4型豬HEV的同源性最高，為84.4%～96.1%。該毒株與2011李文貴等分離自云南的基因4型h亞型豬HEV毒株(JN613156)同源性較最高[20]。同時李文貴等在云南豬群中還分離到HEV基因4型b亞型(JN613152)，這說明在云南地區至少存在b和h兩種亞型。本實驗分離的豬HEV毒株與新疆、武漢和南京等地的HEV同源關系較近，同屬于h亞型，這可能與云南省是一個旅游大省有關。因此，一旦出現HEV污染水源或食物，將可能會導致HEV的暴發流行。本次實驗初步分析了云南省昆明地區豬HEV的序列特征，豐富了HEV進化和分子流行病學的內容，為HEV防治及HEV感染性克隆研究奠定基礎。

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Huang Fen, Email: huangfen6789@163.com

Amplification and evolution analysis on full-length genome of swine hepatitis E virus

YANG Chen-chen,LONG Fei-yan,BI Yan-hong,LI Yun-long, WANG Jue,YU Wen-hai,JING Shen-rong,HUANG Fen

(MedicalFaculty,KunmingUniversityofScienceandTechnology,Kunming650500,China)

To analyze the evolution trend and make a foundation for researching the infectious clone of swine Hepatitis E Virus (HEV), complete genome sequences of swine HEV was amplified by Reverse transcription nested PCR (RT-PCR). The homology and phylogenetic tree were analyzed by DNAStar and MEGA4.0 software, respectively. Results indicated that the full-length genome of swine HEV was successfully amplified by RT-nPCR and RACE. The homology analysis indicated that the swine HEV shared the highest homologies (96.1%) with swine HEV isolated from Xinjiang (GU119961). The phylogenetic tree suggested that this isolate belonged to swine HEV 4h sub-genotype.

swine hepatitis E virus; RT-nPCR; complete genome sequences analysis

國家自然科學基金資助(No.31360619)；云南省自然科學基金(No.2013FB032，2011FZ068)；中國博士后科學基金(No.2014M562672)資助，楊臣臣和龍飛燕同等貢獻。

黃芬，Email:huangfen6789@163.com

昆明理工大學醫學院，昆明 650500

Supported by the Natural Science Foundation of China (No. 31360619), the Natural Science Foundation of Yunnan Province in China (Nos. 2011FZ068 and 2013FB032), and the China Postdoctoral Science Foundation(No. 2014M562672)

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.06.011

R373.2

A

1002-2694(2015)06-0547-05

2015-01-29；

2015-03-30