深圳地區2014年柯薩奇病毒A組4型VP1區基因特征分析

姚相杰，何雅青，蔡春林，卓 菲，楊貴清

深圳地區2014年柯薩奇病毒A組4型VP1區基因特征分析

姚相杰1，何雅青1，蔡春林2，卓 菲2，楊貴清2

目的 對2014年深圳市羅湖區一起皰疹性咽峽炎疫情的病原體進行鑒定，并對鑒定的柯薩奇A4病毒(CVA4)的VP1基因進行序列測定和遺傳進化特征分析。方法 采集疫情中患兒的咽拭子樣本8份,提取病毒核酸,利用熒光RT-PCR法檢測樣本總腸道病毒(EV)、人腸道病毒71型(EV71)、柯薩奇病毒A組16型(CVAl6)、CVA4、CVA6和CVAl0等，對CVA4陽性樣本采用RT-PCR方法擴增其VP1區全長序列,并進行核苷酸序列測定和遺傳進化分析。結果 引起此次皰疹性咽峽炎暴發的病原體為GIB亞型的CVA4病毒。同源性分析顯示，深圳2014年CVA4病毒株與云南2004年分離株(AB268278)、以及臺灣2008年分離株(AB571570)核苷酸同源性達94.1%～94.8%,而與CVA4原型株HIGHPOINT同源性最低，為84.3%。在氨基酸序列上與臺灣2006年分離株(AB571563)、吉林2006年分離株(JQ715709)同源性最高，達99.3%;而與山東省2006年分離株(GQ253375)同源性最低，為97.1%。相比深圳2009年分離株(HQ728260)，共有6個氨基酸突變位點：N22S,T34A，N63S，A165D，T200A和V126A；而進化樹分析顯示，深圳2014年CVA4病毒株雖屬于CVA4的GIB亞型，但在進化走勢上,已經不同于GIB亞型中其他地區早期的分離株。結論 2014年深圳地區CVA4病毒屬于GIB亞型，但在VP1區變異較大。

皰疹性咽峽炎；柯薩奇病毒A組4型；VPl序列分析；亞型

人腸道病毒(Human Enterovirus, HEV)根據其基因親緣性關系可分為A、B、C、D4組。其中A組HEV目前已知包括17個血清型，分別是柯薩奇病毒A組(Coxsackievirus A, CVA)2～8、10、12、14、16型，EV71、76、89～92型[1-2]。引起手足口病(Hand,Foot and Mouth Disease, HFMD)的最主要病原體是 A組HEV中的71型(EV71)和CVA 16型(CVA16)[3-4]。其它血清型的HEV，如CVA 2、4、5、7、10型也可引起HFMD?？滤_奇病毒A4(coxsackievirus A4, CVA4)是能引起HFMD的A組HEV的一種， 也是皰疹性咽峽炎的重要病原體,目前國內尚未見由CVA4感染引起手足口病和皰疹性咽峽炎疫情的報道。本文對2014年深圳市羅湖區某幼兒園暴發的一起皰疹性咽峽炎疫情進行了病原學分子鑒定，同時,對鑒定的CVA4陽性樣本VPl的全長序列進行了分子進化分析。

1 材料與方法

1.1 樣本采集和核酸提取 樣本來源于2014年5月深圳市羅湖區某幼兒園暴發的一起皰疹性咽峽炎疫情?；疾∪藬?人,采集咽拭子樣本8份。采用Roche公司的病毒RNA提取純化試劑盒,取咽拭子標本加入5 mL的Hanks液重懸后，渦旋振蕩1 min后，4 ℃ 8 000 r/min離心5 min，取200 μL上清液，使用瑞士Roche公司的High Pure viral RNA kit試劑盒提取病毒RNA，洗脫體積為50 μL，-80 ℃保存。

1.2 實驗材料 病毒RNA提取純化試劑盒購自羅氏公司；RNA反轉錄試劑盒購自TaKaRa公司；手足口病病原體的實時熒光RT-PCR試劑購自深圳市太太基因股份有限公司；CVA4、CVA6和 CVA10病毒的RNA 熒光PCR 檢測試劑盒均購自深圳市易瑞生物有限公司；PCR引物合成及序列測序均由大連寶生物工程有限公司完成。

1.3 實時熒光RT-PCR檢測 所有臨床標本均進行實時熒光RT-PCR檢測，RNA提取按照說明書進行操作；先應用實時熒光RT-PCR檢測總腸道病毒EV、EV71及CAl6病毒核酸，對于EV核酸陽性、EV71型和CVA16型核酸陰性的樣本判定為其他腸道病毒，然后進行CVA4、CVA6和 CVA10病毒檢測，CVA4病毒檢測的反應條件為45 ℃20 min,1個循環，95 ℃ 10 s 1個循環, 95 ℃ 5 min，53 ℃ 1 min，45個循環。CVA6病毒檢測的反應條件為42 ℃ 8 min,1個循環，95 ℃ 10 s 1個循環, 95 ℃ 5 s，60 ℃ 40 s，45個循環。CVA10病毒檢測的反應條件為50 ℃15 min,1個循環，95 ℃ 3 min 1個循環, 95 ℃ 15 s，55 ℃ 40 s，45個循環。均嚴格依據說明書操作。

1.3 RT-PCR擴增及序列測定 熒光定量PCR檢測結果提示為CVA4病毒陽性,于是挑選Ct值較低的4個樣本參照 CVA4 (GenBank：HQ728260,深圳CVA4病毒2009年分離株)全基因組序列設計引物并擴增VP1基因全長。取3 μL反轉錄好的病毒cDNA為模板，以25 μL反應體系進行PCR反應擴增病毒VP1基因片段。上下引物序列分別為：CoxA4 VPl-up：5′GGTGATGCAATTGCCGATGCTAT3′；CoxA4 VPl-down：5′ TGCGAGCGTTGCTCAGCGTTGTA3′。使用1.5%的瓊脂糖凝膠對PCR產物進行電泳分析。序列測定由大連寶生物工程有限公司完成，然后利用ClustalX，bioedit、DNAStar軟件中的MegAlign等軟件進行序列間的核苷酸的同源性比較，并MEGA6.0軟件構建進化樹，對擴增的CVA4病毒的VP1區進行型別分析。并用DNASTAR軟件進行氨基酸突變分析。

2 結 果

2.1 腸道病毒型別鑒定和病毒VP1基因的擴增 此次皰疹性咽峽炎疫情，共采集樣本8份,經熒光定量PCR檢測鑒定全部為CVA4病毒感染。應用RT-PCR擴增CVA4陽性樣本VP1基因全長,僅4個Ct值較低的樣本擴出VP1基因全長，這4個樣本分別是SZ-SK14030091，SZ-SK14030093，SZ-SK14030097，SZ-SK14030098。

2.2 CVA4病毒的VP1區核苷酸序列特征分析 將擴增出的CVA4病毒的VP1區全長片段進行核苷酸的序列比對分析，發現SZ-SK14030091，SZ-SK14030093，SZ-SK14030097，SZ-SK14030098的核苷酸同源性為100%，同屬于GIB亞型。同時，將本次疫情發現的4株CoxA4病毒VP1序列分別與GenBank中檢索到的國內外部分CoxA4各基因型與基因亞型的VPl區進行核苷酸同源性比對，其參考序列如表1。核苷酸序列上，2014年深圳CVA4病毒株與云南2004年分離株AB268278-04-CN-163-YUNAN、深圳2009年分離株HQ728260CVA4/SZ/CHN/09以及臺灣2008年分離株08-TW-05168同源性最高，達94.1%～94.8%,而與CVA4原型株HIGHPOINT同源性最低，為84.3%。

表1 序列分析中所用CVA4毒株信息

2.3 CVA4病毒VP1區氨基酸序列分析 進一步分析氨基酸序列，發現深圳CVA4病毒2014株SZ-SK14030091，SZ-SK14030093，SZ-SK14030097，SZ-SK14030098在氨基酸序列上與臺灣2006年(AB571563,06-TW-03242)、2007年分離株(AB571560,07-TW04122)，以及吉林2006年分離株JQ715709同源性最高，均達99.3%;與山東省2006年分離株GQ253375-06-CN-06236-SD同源性最低，為97.1%。相對于深圳CVA4病毒2009年分離株(HQ728260)，深圳2014年分離株變異較大，共有6個氨基酸突變：N22S,T34A，N63S，A165D，T200A和V126A。

2.4 CVA4 VPl區系統進化親緣關系分析 應用Mega5.05軟件中Neighbor-Joining方法對2014年深圳CVA4病毒株和24株GenBank中的代表株基于VPl基因序列構建系統進化樹進行分析。由圖1顯示，此次擴增的深圳地區CVA4病毒均屬于G1基因群的GIB亞型。進化樹上看，2004年云南株AB268278，吉林2006年的一株分離株JQ715709，山東2006和2008年分離株(GQ253372，GQ253375)均與臺灣2006,2007,2009年分離株(AB571560、 AB571563和AB571574))來自一個進化分支，而山東2010年分離株(KF150144)，云南2012年分離株AB759895,深圳2009年分離株(HQ728260)與臺灣2008年分離株(AB571570)來自同一個分支。同源進化分析結果標明，2014年深圳地區的CVA4病毒株雖屬于GIB亞型,但已經獨立形成一個分支。

3 討 論

圖1 2014年深圳CVA4和各基因型代表株CVA4 VP1段系統進化分析

Fig.1 Phylogenetic analysis of CVA4 amplified in Shenzhen and other representative CVA4 strains based on VP1 full length sequences

CVA4病毒屬于腸道病毒A組成員，該組成員包括柯薩奇病毒A組的16、4、5、7、9、10型以及腸道病毒71型，其中柯薩奇A16病毒和EV71病毒是引起我國手足口病的主要病原體。近年來，由于引起手足口病的病原譜發生變化，非EV71和非CVA16陽性的其他腸道病毒陽性比例逐漸增大，EV71和CVA16的比例有所下降，CVA4病毒逐漸引起人們的關注。CVA4 屬于柯薩奇病毒A 組成員，其基因組為單股正鏈RNA，長度約為7 435個核苷酸，僅含有一個開放讀碼框架(Open Reading Frame, ORF)，編碼4個結構蛋白(VP4、VP2、VP3、VP1)和7個非結構蛋白[5]，可引起皰疹性咽峽炎和手足口病。2004年、2006年我國臺灣地區先后2次出現CVA4病毒引起的手足口病大暴發，而2010年又與CVA16的共循環，而北京、吉林、廣州等地雖未報道由CVA4引發的暴發疫情，但也在手足口病患兒的糞便樣本中檢測到了該病毒的存在。CVA4病毒的傳播流行已經給嬰幼兒健康帶來潛在的威脅[6-7]。

本研究應用分子生物學方法對2014年深圳市羅湖區某幼兒園的一起皰疹性咽峽炎疫情的病原體進行了鑒定。熒光RT-PCR檢測結果顯示，引起2014年深圳市羅湖區某幼兒園皰疹性咽峽炎疫情的病原體為CVA4病毒。為進一步了解該病毒在深圳地區的分子進化特點，又對其中4份Ct值較低的樣本VP1區進行了序列測定。結果顯示此次疫情中的4個CVA4病毒樣本SZ-SK14030091，SZ-SK14030093，SZ-SK14030097，SZ-SK14030098的核苷酸和氨基酸同源性均為100%，這進一步證實這些病毒株樣本來自同一起疫情。上述結果表明，深圳地區存在著CVA4病毒大范圍流行的可能性。本研究系國內首起有關CVA4病毒導致的皰疹性咽峽炎疫情的報道，由于有關CVA4病毒所導致的手足口病和皰疹性咽峽炎的臨床癥狀和預后尚不清楚，因此在未來將進一步加強對CVA4病毒的監測和觀察。由于目前國內外對CVA4病毒的研究報道相對還是較少，為了闡明深圳地區CVA4病毒株的分子流行病學特征，探討CVA4病毒深圳株與國內外其他地區分離株的區別和聯系，本研究對該病毒進行了核苷酸和氨基酸序列的遺傳進化分析。結果顯示，深圳CVA4病毒2014株與云南2004年分離株AB268278同源性最高，達94.8%，其次為臺灣2008年分離株AB571570，達94.5%；而在氨基酸序列上與臺灣2006年分離株(AB571563)、吉林2006年分離株(JQ715709)同源性最高，達99.3%，而進化樹分析則顯示深圳2009年(HQ728260)、2014年CVA4病毒株(SZ-SK14030091，SZ-SK14030093，SZ-SK14030097，SZ-SK14030098)與臺灣地區的CVA4病毒株均屬于CVA4的GIB亞型，由于臺灣地區在2004,2006年兩度暴發CVA4病毒導致的手足口病疫情，而在中國大陸目前尚未見有關CVA4病毒導致的手足口病疫情或皰疹性咽峽炎疫情暴發的報道，提示深圳地區CVA4病毒株與臺灣株有著較為緊密的聯系。同時，相比深圳2009 CVA4病毒株，深圳2014年CVA4病毒株在進化走勢上發生了變化，在CVA4病毒GIB亞型內部已經形成了一個獨立分支(見圖1)。此外，深圳CVA4病毒2014株(SZ-SK14030091，SZ-SK14030093，SZ-SK14030097，SZ-SK14030098)相對于2009株(HQ728260)在氨基酸位點發生了較大改變，共有6個氨基酸突變位點：N22S,T34A，N63S，A165D，T200A和V126A，這些突變是否改變對CVA4病毒的毒力大小，改變CVA4病毒的傳播流行規模值得關注。

總之,CVA4病毒是引起2014年深圳市羅湖區某幼兒園皰疹性咽峽炎疫情的病原體，鑒于該病毒在2004、2006年曾引起我國臺灣地區手足口病疫情大暴發，因此在手足口病監測中除了對EV71和CVA16等常見病原的檢測外，還應加強對CVA4等不常見病原的分型鑒定及分子流行病學分析，及時了解科薩奇病毒的病原分布及變異情況，進而為制定科學有效的防控措施提供依據。

[1]Ji YL, Wang YQ, Identification and sequence analysis of the 5′UTR-VP4-VP2 region of coxsakievirus A4 isolated from patients with hand foot and mouth disease[J]. Chin Prev Med, 2012, 13(9): 675-678. (in Chinese) 吉彥莉,王永全.手足口病患兒柯薩奇病毒A4的鑒定及其5′UTR-VP4-VP2區序列分析[J].中國預防醫學雜志,2012,13(9):675-678.

[2]Yang F, Zhang T,Hu Y, et al. Survey of enterovirus infections from hand, foot and mouth disease outbreak in China, 2009[J]. Viral J,2011,8(508): 1-4.

[3]Wu Y,Yeo A, Phoon MC,et al. The largest outbreak of hand，foot and mouth disease in Singapore in 2008：the role of enterovirus71 and coxsackievirus A strains[J].Int J Infect Dis,2010,14(12):e1076-1081.

[4]Liu JF, Zhang Y, Li H, et al. Genetic characterization of VP4-VP2 of two Coxsackievirus A4 isolated from patient with hand, foot and mouth disease[J].Chin J Vaccine Immunizat, 2009, 15(4): 345-349. (in Chinese) 劉建鋒,張勇,李慧,等.從手足口病病例分離的兩株柯薩奇病毒A組4型毒株的VP4～VP2區基因特征分析[J].中國疫苗和免疫,2009,15(4):345-349.

[5]Oberste MS, Penaranda S,Maher K,et al.Complete genome sequences of all members of the species Human enterovirus A[J].J Gen Virol,2004,85(Pt 6): 1597-1607.

[6]Chu PY, Lu PL, Tsai YL,et al. Spatiotemporal phylogenetic analysis and molecular characterization of coxsackievirus A4[J].Infect Genet Evol,2011,11(6):1426-1435.

[7]Zhen RN,Zhang Y,Xie HP,et al.Sequence analysis of coxsackievirus A4 and coxsackievirus A10 in Guangzhou city, 2010-2012[J]. Chin J Prev Med,2014,48(6):445-450.(in Chinese) 甄若楠,張穎,謝華萍,等.2010-2012年廣州市柯薩奇病毒A4、A10型VPl基因特征分析[J].中華預防醫學雜志,2014,48(6):445-450.

HE Ya-qing, Email: heyaqing1019@126.com

Gene mutation of coxsackievirus A4 VP1 from Shenzhen, China, 2014

YAO Xiang-jie1,HE Ya-qing1,CAI Chun-lin2,ZHUO Fei2,YANG Gui-qing2

(1.LaboratoryofInfectiousDiseasesandSurveillance,ShenzhenCenterforDiseaseControlandPrevention,Shenzhen518055,China; 2.LuohuCenterforDiseaseControlandPrevention,Shenzhen518020,China)

We identified the pathogen causing an outbreak of herpangina in Shenzhen in 2014. Phylogenic analysis was carried out on VP1 genetic region of coxsackievirus A4 isolated from this outbreak. Eight throat swab specimens were collected from patients during the outbreak. The RNA was extracted from the virus and real-time RT-PCR method was used to test virus such as human enterovirus71, coxsackievirus Al6, coxsackievirus A4, coxsackievirus A6, and coxsackievirus A10. Complete VP1 gene of CVA4 identified in the outbreak was amplified by RT-PCR technique. Phylogenetic trees based on entire and partial VP1 sequences were constructed among CVA4 gene and others published in GenBank. It showed that CVA4 with GIB type was the pathogen in this outbreak. Data from homological comparisons indicated 4 CVA4 strains amplified in this outbreak had the highest nucleotide acid identity with the isolates from Yunnan in 2004 (AB268278), Shenzhen in 2009 (HQ728260), and Taiwan in 2008 (AB571570). The homologies of nucleotide sequences among them were 94.1%- 94.8%, which has the lowest identity (84.3%) with the prototype strain (HIGHPOINT strain). However, the 4 CVA4 strains amplified in this outbreak had the highest amino acid identity (99.3%) with the isolates from Taiwan in 2006 (AB571563), Jilin in 2009 (JQ715709), and the lowest amino acid identity (97.1%) with the isolates from Shandong in 2006 (GQ253375). Comparing with the CVA4 isolate from Shenzhen in 2009, 6 amino mutation were found in the four CVA4 strain (N22S,T34A, N63S, A165D, T200A and V126A ). Result of the analysis on phylogenetic tree showed that the 4 CVA4 stains were still belong to GIB subtype, however, it is obviously different with other stains in GIB group gained in other place in different time. In conclusion, the four CVA4 stains identified in Shenzhen, 2014 belongs to GIB subtype, which were found to have great difference on VP1 region.

herpangina; coxsackievirus A4; VP1 sequence analysis; subtypes

何雅青，Email: heyaqing1019@126.com

1.深圳市疾病預防控制中心重大傳染病監控實驗室，深圳 518055; 2.深圳市羅湖區疾病預防控制中心微生物檢驗科，深圳 518020

Support by Medical Scientific Research Foundation of Guangdong Province,China(No.A2013602)

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.06.015

R373.2

A

1002-2694(2015)06-0565-04

2014-10-11；

2015-03-15

廣東省醫學科研基金(No.A2013602)