DNA條形碼技術在麻蠅亞科鑒定中的應用

方義亮，張建慶，肖 武，高 博，房長天，卞玘璠，徐保海

DNA條形碼技術在麻蠅亞科鑒定中的應用

方義亮1，張建慶1，肖 武1，高 博1，房長天1，卞玘璠2，徐保海3

目的 建立麻蠅亞科種類鑒定的DNA條形碼技術，以期解決麻蠅亞科雌性個體無法通過形態鑒定的問題。方法 通過對福建口岸截獲的黑尾黑麻蠅、黃須亞麻蠅、褐須亞麻蠅、棕尾別麻蠅、醬亞麻蠅等標本進行PCR擴增和序列測定，與BOLD上下載的88條麻蠅亞科蠅種序列進行比對，計算遺傳距離、構建系統進化樹。結果 5份樣本擴增獲得COI的長度為658 bp，在線BLAST比對結果顯示相似度99%以上，遺傳距離計算結果顯示種內差異0～0.015 4，種間差異0.024 9～0.153 8，系統進化樹顯示麻蠅亞科同種能聚在一塊，Bootstrap值為1 000。結論 DNA條形碼技術可以作為麻蠅亞科蠅種鑒定在形態學鑒定之外的重要方法補充。

DNA條形碼；COI;蠅類鑒定

麻蠅科是國境口岸醫學蠅類監測的重要部分，種類繁多，全世界已知共有2 500余種，在我國也有312種[1](2003年)。麻蠅亞科系我國麻蠅科中最重要的亞科，種類也最多，與人類關系密切。麻蠅亞科的外部共同特征有：后足基節在上部后表面有細的柔毛群，有時這些毛很少是短毛或裸；腹部底色黑，無界限分明的斑，而具黑白方塊相間的斑紋，即棋盤狀斑。麻蠅亞科多數種類形態比較接近，形態鑒定主要依據雄蟲尾器，而雌蟲鑒定比較困難，另外若截獲的標本殘缺不全，形態鑒定便無法進行。DNA條形碼技術(DNA Barcoding)是利用目的DNA片段序列區分生物物種的一種全新方法，近幾年得到了快速的發展，因其能不受發育狀態、性別、形態完整性影響，在昆蟲鑒定方面得到廣泛的應用[2]，本文通過DNA條形碼技術對福建口岸常見的麻蠅亞科蠅種進行鑒定，以期在國境口岸醫學媒介生物鑒定中，作為形態學鑒定之外的重要方法補充。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實物樣本來源 ①黑尾黑麻蠅(Helicophagellamelanura)②黃須亞麻蠅(Parasarcophagamisera)③褐須亞麻蠅(Parasarcophagasericea)④棕尾別麻蠅(Boettcheriscaperegrina)⑤醬亞麻蠅(Parasarcophagadux)均由福建口岸采集或者截獲標本。

1.1.2 虛擬樣本來源 虛擬樣本來自BOLD數據庫(http://boldsystems.org/)，檢索關鍵詞Sarcophaginae(麻蠅亞科),以引物與本研究相同為條件，經篩選共得37個蠅種88條記錄，詳細見表1。

1.1.3 主要試劑和引物 昆蟲基因組提取試劑盒,ExTaq、25 mmol/L MgCl2、10×buffer、2.5 mmol/L dNTP購自寶生物工程(大連)有限公司,PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成,引物，見表2。

表1 BOLD檢索數據匯總表

表2 引物

1.2 方法

1.2.1 形態鑒定 麻蠅亞科雄性蠅通過拉出尾器并固定，結合其他體表特征，參見相關書籍檢索表[1]進行形態鑒定。

1.2.2 蠅蟲基因組提取 取蠅蟲單只蠅足清洗后，通過昆蟲基因組提取試劑盒進行蠅蟲基因組提取。

1.2.3 PCR擴增與產物電泳 擴增體系25 μL，其中Taq酶 0.125 μL，25 mmol/L MgCl22 μL，10×ExTaqBuffer 2.5 μL ，2.5 mmol/L dNTP 2 μL，上下引物各 0.5 μL，雙蒸水15.875 μL，DNA模版1.5 μL，并按以下條件進行反應：94 ℃ 3 min預變性；94 ℃ 30 s 變性，50 ℃ 30 s退火，72 ℃ 45 s 延伸，35個循環；72 ℃ 5 min后延伸。

擴增后的產物加樣置于電泳槽直流電壓130 V，30 min進行電泳。電泳后置于凝膠成像系統拍照。

1.2.4 序列測定 PCR擴增產物送至上海生工生物工程技術服務有限公司純化，并用四色熒光標記雙脫氧鏈終止法測序(AB公司DNA測序儀3730 生工生物工程公司(上海)有限公司)，測序的引物為PCR擴增引物，正反鏈雙向測序以保證序列的準確性。

1.2.5 序列分析 1)用CodonCode軟件查看測序獲得的序列，去除低質量的末端序列與引物序列，并進行序列組裝，將組裝完成的序列保存為.fasta格式。2)在NCBI(美國國立生物技術信息中心http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)進行在線BLAST對比。3)將上述所獲得的8組序列片段進行對比(ClustalW)，之后進行遺傳距離計算并構建NJ樹(Neighbor-joining Tree)，參數選擇為Kimura雙參數距離(K2P)模式，Bootstrap值為1 000。

2 結 果

2.1 蠅種基因組提取及測序結果 本次實驗共提取出8個蠅種的DNA。片段核苷酸長度在750 bp左右，經過分析軟件去除雜帶和引物后，剩下的核苷酸片段長度為658 bp。

2.2 在線BLAST結果 見表3。其結果表明實驗樣品與GenBank已知序列相似度較高(>99%)，與形態鑒定結果相符合。③號樣本與BLAST比對結果不一致，但實為同種異名[4]。

表3 不同蠅種在線BLAST比對結果

2.3 序列分析與遺傳距離 本研究中麻蠅亞科蠅種共計39種92個體的堿基平均組成為：A=29.61%,T=36.89%,C=17.30%,G=16.20%,A+T=66.5%，具有明顯的A+T傾向性。

經過計算麻蠅亞科92個不同個體的不同蠅種的遺傳距離獲得麻蠅亞科不同蠅種種間差異0.0 249～0.1 538，種內差異0～0.0 154(<2%)(如圖1所示)，種間差異和種內差異沒有交叉，表明COI(658 bp)序列能較好地對麻蠅亞科的不同種類進行鑒別，種內差異小于2%即可判斷為同一種。

2.4 系統進化樹構建 如圖2所示，麻蠅亞科中同一種能夠較好地歸為一類，同時Bootstrap值都在99以上。本實驗中的實物標本黃須亞麻蠅同AUSFF264-11，AUSFF268-11，AUSFF250-11聚一類，Bootstrap值為100； 褐須亞麻蠅同AUSFF319-11，AUSFF295-11，AUSFF313-11聚一類，Bootstrap值為100；棕尾別麻蠅同AUSFF082-08聚一類，Bootstrap值為100；醬亞麻蠅同AUSFF229-11，AUSFF228-11，AUSFF235-11聚一類，Bootstrap值為100，以上鑒定結果都同形態鑒定相符合。

圖1 麻蠅亞科不同蠅種種間差異和種內差異

Fig.1 Interspecific and intraspecific difference of different Sarcophaginae species

3 討 論

DNA條形碼技術于2003年由Hebert[5]等提出來以后，因其有不受物種發育階段的影響、不受物種個體特征的影響、不受物種的限制、可以鑒定出許多群體中普遍存在的隱存分類單元、獲取信息量大、精確性高、操作方法簡便、高效且易掌握等優點，而被廣泛應用于醫學媒介生物的鑒定。Cywinska等[6]對加拿大的37種蚊類進行研究，結果表明，屬間差異比種間差異高近20倍，屬間差異平均為10.4%，種間差異平均0.5%。張映梅等[7]對我國44種重要蚤類進行DNA條形碼初步研究，結果表明，同種個體之間的同源性達到99%以上，不同種之間的同源性最高僅為90%，且幾乎所有蚤類都能被DNA條形碼正確鑒定。孫毅等[8]對中國硬蜱科30種重要種類進行了研究，結果表明COI基因核苷酸序列的種內差異小于3%，種間差異大于25%，且沒有種間交叉，對已測定的30種蜱鑒定正確率可達到100%。本研究遺傳距離計算結果顯示種內差異0～0.0 154(<2%)，種間差異0.0 249～0.1 538，種內差異小于種間差異，種內差異與種間差異無交叉，結論與上述研究是一致。

從目前眾多的DNA條形碼技術研究來看，DNA條形碼技術在生物鑒定方面具有技術可行性，很適合應用于形態學無法鑒定，或者對未知種類的鑒定，但就目前技術成本來看，DNA條形碼技術所需的實驗成本較高，不太適合于平時高通量的醫學媒介生物鑒定，另外因為該技術對實驗室的實驗器材和實驗人才的實驗水平有一定的要求，不太適合在口岸一線做大面積推廣，最后,該項技術的應用很大程度依賴于DNA條形碼庫的構建和擴充，而雖然目前國內外都致力于開發DNA條形碼庫，但仍存在庫中的生物條形碼有些種類欠缺的情況。總之，DNA條形碼技術作為新興的技術，目前在口岸醫學媒介生物鑒定中可作為傳統形態學鑒定方法的重要補充，但其發展和成熟有賴于技術進一步規范和統一，同時需要條形碼庫的進一步完善和補充。

圖2 92種麻蠅亞科不同蠅種COI基因序列(658bp)NJ(鄰接法)樹

Fig.2 NJ (neighbor-joining) tree of 92 Sarcophaginae species based on COI gene fragment (658 bp)

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Sarcophaginae identification by DNA-barcoding

FANG Yi-liang1,ZHANG Jian-qing1,XIAO Wu1,GAO Bo1,FANG Chang-tian1,BIAN Qi-fan2,XU Bao-hai3

(1.FujianInternationalTravelHealthcareCenter,Fuzhou350001,China; 2.FujianMedicalUniversity,Fuzhou350004,China; 3.FujianCenterforDiseaseControlandPrevention,Fuzhou350001,China)

In this study, we aimed to establish method for identifying Sarcophaginae by DNA-barcoding and to solve the problem that Sarcophaginae female species could not be identified by morphology. We amplified and analyzed the sequences of these samples in Fujian frontier such asHelicophagellamelanura,Parasarcophagamisera,Parasarcophagasericea,Boettcheriscaperegrine,Parasarcophagabrevicornis,Parasarcophagadux,Parasarcophagasimilis,Parasarcophagaalbiceps,ParasarcophagaPingi, andSeniorwhiteareciproca. Secondly, we aligned these sequences with 88 Sarcophaginae species loaded from BOLD. Thirdly, we estimated the genetic distances and built system evolutionary tree. The result of amplification with 5 samples showed that length of the obtained COI sequences were 658 bp. And the result of alignment on BOLD line showed that index of similarity of the same species was above 99%. The result of calculation genetic distances showed that intraspecific difference was 0-0.015 4 and interspecific difference was 0.024 9-0.153 8. Phylogenetic tree showed that the same Sarcophaginae species stayed together on value of Bootstrap 1000. It came to a conclusion that DNA-barcoding can be the important method to supplement of morphologically identifying Sarcophaginae.

DNA-barcoding; COI; identifying flies

1.福建國際旅行衛生保健中心，福州 350001； 2.福建醫科大學公共衛生學院,福州 350001 3.福建省疾病預防控制中心,福州 350001 Email: anew627@163.com

Supported by the Science and Technology Plan of Fujian Entry-Exit Inspection & Quarantine Bureau of P.R.C (No. FK2012-12)

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.06.016

R384.2

A

1002-2694(2015)06-0569-05

2014-08-19；

2014-12-24

福建檢驗檢疫局科技計劃項目基金(No.FK2012-12)