基于生物效價(jià)的雙黃連制劑質(zhì)量控制研究

李穆睿 張 慧 王 叢 徐 凱 熊小涵

遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 116600

基于生物效價(jià)的雙黃連制劑質(zhì)量控制研究

李穆睿 張 慧*王 叢 徐 凱 熊小涵

遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 116600

目的：研究雙黃連制劑體外抗菌效價(jià)檢測(cè)方法，建立基于生物檢定的雙黃連制劑質(zhì)量評(píng)價(jià)模式。 方法：按照中國(guó)藥典(2010版)規(guī)定的生物檢定法中的管碟法，以金黃色葡萄球菌為菌種，建立生物效價(jià)評(píng)價(jià)雙黃連制劑的方法，并對(duì)不同廠家的雙黃連口服液的抗菌效價(jià)進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果：雙黃連制劑體外抗菌實(shí)驗(yàn)量效之間具有良好的線性關(guān)系，不同廠家的雙黃連口服液抗菌效價(jià)為10.278U～15.7276U。結(jié)論：生物效價(jià)檢測(cè)方法可以作為雙黃連制劑質(zhì)量控制的一種方法。

雙黃連制劑；質(zhì)量控制；生物效價(jià)；管碟法

中藥制劑質(zhì)量控制方法目前常用含量測(cè)定法，一般以某種或幾種有效成分為對(duì)照，但中藥制劑不同于成分單一的化學(xué)藥，其成分復(fù)雜，具有多成分、多靶點(diǎn)的藥理作用，僅依靠某種或幾種有效成分難以全面評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量，更難以體現(xiàn)中藥的整體效應(yīng)。借鑒生物制品質(zhì)量控制模式，建立中藥制劑基于生物效價(jià)檢測(cè)的中藥質(zhì)量控制方法，用以完善現(xiàn)行的中藥質(zhì)量控制體系[1]。

生物效價(jià)測(cè)定法是鑒定制劑質(zhì)量的一種新方法，利用藥物對(duì)生物體所產(chǎn)生的影響，測(cè)定藥物的生物效價(jià)。用此方法控制中藥質(zhì)量，可以對(duì)藥品的藥效、毒副作用進(jìn)行評(píng)價(jià)，尤其對(duì)于某些理化方法無(wú)法探明含量、無(wú)法表征生物活性的中藥制劑更有其明顯的優(yōu)越性。目前已有文獻(xiàn)采用生物鑒定法對(duì)含小檗堿類中藥進(jìn)行研究[2]，以生物效應(yīng)為為核心藥效控制藥材的質(zhì)量，取得了一定進(jìn)展。迄今為止，尚未見采用生物效價(jià)測(cè)定法控制成方制劑質(zhì)量的研究報(bào)道。

雙黃連制劑由金銀花、黃芩、連翹組成，具有疏風(fēng)解表、清熱解毒的功效。臨床用于外感風(fēng)熱引起的發(fā)熱、咳嗽、咽痛[3]。本文以雙黃連相關(guān)制劑為例，對(duì)處方中三味藥材的生物效價(jià)進(jìn)行系統(tǒng)研究，以期控制制劑的質(zhì)量。為有效進(jìn)行雙黃連制劑的質(zhì)量控制研究，以多種不同廠家的雙黃連制劑為研究對(duì)象，以藥典規(guī)定的雙黃連含量測(cè)定成分為參考，制定基于生物效價(jià)的雙黃連制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 1/10萬(wàn)電子天平(Sartorius公司，德國(guó))；高溫高壓高濕滅菌鍋(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；恒溫培養(yǎng)箱(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司)；血細(xì)胞計(jì)數(shù)板(上海求精生化試劑儀器有限公司)；牛津杯[內(nèi)徑(6.0±0.1)mm、外徑(7.8±0.1)mm、高(10.0±0.1)mm]；游標(biāo)卡尺(上海寶琴工具有限公司)；陶瓦蓋。

1.2 試劑 慶大霉素(批號(hào)：130326-201015，標(biāo)定效價(jià)為630U/mg，中國(guó)藥品生物制品檢定所提供)； 金黃色葡萄球菌[staphylocoeccus aureus CMCC(B)26003](中國(guó)藥品生物制品檢定所)；營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(蛋白胨10g，牛肉粉3g，氯化鈉5g，瓊脂15g，北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司)；水為無(wú)菌超純水；其余試劑均為分析純。

1.3 藥品 雙黃連口服液(批號(hào)：112112025，河南太龍藥業(yè)股份有限公司；批號(hào)：13052416，哈藥集團(tuán)三精制藥股份有限公司；批號(hào)：10121321，河南太龍藥業(yè)股份有限公司；批號(hào)：20141020，東莞市亞洲制藥有限公司；批號(hào)：121021，河南福森藥業(yè)有限公司；批號(hào)：120905，南陽(yáng)市新生制藥有限公司；批號(hào)：110317，哈爾濱匯利藥業(yè)有限公司；批號(hào)：B20130104，黑龍江珍寶島藥業(yè)股份有限公司；批號(hào)：110306，黑龍江瑞格制藥有限公司；批號(hào)：110506哈高科白天鵝藥業(yè)集團(tuán)有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗(yàn)材料準(zhǔn)備 參照中國(guó)藥典(2010年版)二部“抗生素微生物檢定法-管碟法操作”[4]。

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)品的制備 精密稱取慶大霉素適量，加pH7.8的磷酸鹽溶液稀釋0.01μg/ml作為標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。

2.1.2 供試品的制備 精密量取雙黃連口服液樣品5ml，至10ml容量瓶中，用無(wú)菌水定容至刻度，蒸汽滅菌30min，存于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.3 菌懸液的制備 取金黃色葡萄球菌的營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，另取營(yíng)養(yǎng)瓊脂接種，在37℃下培養(yǎng)20～22h，取3、4代細(xì)菌的培養(yǎng)物，用無(wú)菌水將菌苔洗下后，制成懸液，使用血球計(jì)數(shù)板調(diào)節(jié)濁度為2.0麥?zhǔn)媳葷岫龋瑐溆谩?/p>

2.1.4 雙碟的制備[5]于雙碟中加入高溫滅菌后的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基20ml，使其在碟內(nèi)均勻平鋪，并在水平操作臺(tái)上冷卻凝固，作為底層。另取培養(yǎng)基適量，高溫滅菌后放冷至50℃，加入占培養(yǎng)基體積1%的懸菌液，搖勻，在每一雙碟中分別加入5ml，作為菌層。待冷卻后，在每一雙碟中均勻等距放置6個(gè)牛津杯，備用。

2.2 效價(jià)檢測(cè)的方法學(xué)檢查

2.2.1 方法 采用管碟法，測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)實(shí)驗(yàn)菌產(chǎn)生的抑菌圈直徑，進(jìn)行分析考察。

2.2.2 劑量反應(yīng)關(guān)系考察 取制備完畢的雙碟2只，分別均勻等距安置4個(gè)牛津杯，用陶瓦圓蓋覆蓋備用，分別取標(biāo)準(zhǔn)品按照1∶0.8劑距分別用磷酸鹽溶液稀釋至10、8、6.4、5.12、4.096、3.278、2.62、2.10μg/ml的溶液0.3ml加樣，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20h，取出，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑D值，結(jié)果見表1。

表1 慶大霉素磷酸鹽溶液對(duì)金黃色葡萄球菌作用的劑量反應(yīng)關(guān)系試驗(yàn)數(shù)據(jù)表

Tab.1 gentamicin phosphate solution effect on staphylococcus aureus, the dose-response relationship between the test data table

試驗(yàn)次數(shù)不同濃度樣品C(μg/ml)作用下的D(mm)值2.102.623.2784.0965.126.4810115.6815.8317.8918.1520.3522.6025.2330.81215.2716.4817.4318.7220.4722.7226.0330.92314.9816.2017.2918.3520.0322.3925.6430.60415.1416.4117.6118.7119.9621.9226.5231.37515.3216.2916.8518.8020.3023.4026.6530.73615.4816.1217.2218.9819.9722.8725.9530.99

以抑菌圈直徑D(mm)為橫坐標(biāo)X，標(biāo)準(zhǔn)品濃度C(μg/ml)為縱坐標(biāo)Y，經(jīng)線性回歸，得回歸方程為Y=1.9273X+10.882，R2=0.9921，若以抑菌圈直徑D(mm)為橫坐標(biāo)X，標(biāo)準(zhǔn)品濃度C(μg/ml)的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)Y，經(jīng)線性回歸，回歸方程為Y=0.0381X，R2=0.9991。結(jié)果表明，在2.10～10μg/ml范圍內(nèi)慶大霉素磷酸鹽溶液的對(duì)數(shù)值與抑菌圈直徑進(jìn)行直線回歸處理，劑量反應(yīng)關(guān)系系數(shù)R均大于0.99，說(shuō)明慶大霉素磷酸鹽溶液的濃度在2.10～10μg/ml范圍內(nèi)，與抑菌圈直徑有較好的量效關(guān)系。

2.2.3 精密度試驗(yàn) 取標(biāo)準(zhǔn)品溶液，稀釋至6.4μg/ml，按上述條件重復(fù)測(cè)定5次，精密測(cè)量各抑菌圈直徑D值，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值低于1%，具有較好的精密度。

2.2.4 中間精密度試驗(yàn) 邀請(qǐng)不同試驗(yàn)人員，在不同時(shí)間，取標(biāo)準(zhǔn)品溶液，稀釋至6.4μg/ml，按上述條件重復(fù)測(cè)定5次，精密測(cè)量各抑菌圈直徑D值計(jì)算RSD值均低于2%，具有較好的中間精密度。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液，分別于0、l、4、8、24h按上述條件測(cè)定各抑菌圈直徑D值，計(jì)算RSD值均低于2%。結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取標(biāo)準(zhǔn)品溶液，稀釋至6.4μg/ml，共5份，按上述條件測(cè)定各抑菌圈直徑D值，計(jì)算RSD低于1%。結(jié)果表明，所采用的測(cè)定方法重復(fù)性良好。

2.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 采用量反應(yīng)平行線(3·3)法，隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，將標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液按照1∶0.8隨機(jī)分成高、中、低6組，前三組接受標(biāo)準(zhǔn)品的3個(gè)劑量，后三組接受供試品的3個(gè)劑量。取6只制備完成的雙碟，在每一雙碟中一側(cè)的3個(gè)牛津杯分別滴加高(SH)、中(SM)、低(SL)濃度的慶大霉素磷酸鹽溶液，另一側(cè)3個(gè)牛津杯分別滴加高(TH)、中(TM)、低(TL)3種濃度的雙黃連口服液供試品溶液，加樣量均為0.3ml，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20h后，精密測(cè)量各個(gè)抑菌圈直徑，使用生物檢定統(tǒng)計(jì)程序BS2000版[6-7]中的(3·3)法進(jìn)行可靠性測(cè)驗(yàn)、效價(jià)計(jì)算和試驗(yàn)誤差估計(jì)。

2.4 結(jié)果與小結(jié)

2.4.1 效價(jià)計(jì)算結(jié)果,結(jié)果見表2。

表2 不同產(chǎn)地雙黃連口服液抗菌效價(jià)的測(cè)定結(jié)果 Tab.2 the results of different manufacturers ShuangHuangLian oral liquid on the determination of antibiotic

2.4.2 小結(jié) 試驗(yàn)應(yīng)用生物檢定中的管碟法對(duì)不同廠家的雙黃連口服液進(jìn)行抑菌效價(jià)的檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果均能通過(guò)可靠性檢測(cè)，表明雙黃連制劑可以通過(guò)量反應(yīng)平行線(3·3)法進(jìn)行效價(jià)計(jì)算和實(shí)驗(yàn)誤差估計(jì)。由于1ml供試品溶液中含有0.5ml雙黃連口服液，上述檢測(cè)結(jié)果經(jīng)過(guò)換算可以得出，不同廠家的雙黃連制劑抑菌效價(jià)存在差異，抗菌效價(jià)為10.278～15.7276U，因此暫定每1ml雙黃連口服液抑菌效價(jià)不得低于9.3300U。

3 討論

3.1 管碟法檢測(cè)條件的選擇與優(yōu)化 按照中國(guó)藥典(2010年版)二部微生物鑒定法管碟法測(cè)定樣品對(duì)雙碟中培養(yǎng)菌產(chǎn)生的抑菌圈，應(yīng)用單因素實(shí)驗(yàn)法確定培養(yǎng)菌接種量和培養(yǎng)時(shí)間對(duì)抑菌圈的影響。

3.2 培養(yǎng)菌接種量的考察 應(yīng)用第3代金黃色葡萄球菌，菌懸液濁度分別調(diào)整為0.5、1.0、1.5、2.0麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)(MCF)。結(jié)果表明，菌懸液濁度在0.5～2.0MCF范圍內(nèi)，抑菌圈直徑不明顯，當(dāng)接種量為2.0MCF時(shí)，菌層生長(zhǎng)良好并且抑菌圈分界清晰，因此2.0MCF為適宜的培養(yǎng)菌接種量。

3.3 培養(yǎng)時(shí)間的考察 在相同條件下，分別考察14.0、14.5、15.0、15.5、16.0h等不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)試驗(yàn)抑菌圈產(chǎn)生的影響。結(jié)果表明，培養(yǎng)時(shí)間為15.0h時(shí)抑菌圈直徑(即效應(yīng)值)較大，菌層生長(zhǎng)良好并且抑菌圈分界清晰。因此培養(yǎng)時(shí)間選定為15.0h。

[1] 肖小河，金城，趙中振，等．論中藥質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)模式的創(chuàng)新與發(fā)展[J]．中國(guó)中藥雜志，2007，32(14)：1377-1381．

[2] 方藝霖．含小檗堿類中藥品質(zhì)生物評(píng)價(jià)與控制的初步研究[D]．成都:成都中醫(yī)藥大學(xué)，2008：35-48．

[3] 王小平，劉雅華．貴州省習(xí)用金銀花抑菌作用初探[J]．中國(guó)民族民間醫(yī)藥,1998，6(34)：40-41．

[4] 國(guó)家藥典委員會(huì)．中華人民共和國(guó)藥典二部[S]．北京:化學(xué)工業(yè)出版社．2010：附錄93-95．

[5] 王美珍．培養(yǎng)基對(duì)抗生素效價(jià)測(cè)定的影響[J]．中國(guó)民族民間醫(yī)藥,2010，18(3)：68.

[6] 沈連忠，李波．中國(guó)藥典生物檢定統(tǒng)計(jì)軟件BS2000For Windows9X[J]．中國(guó)衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)，2000，17(6)：330．

[7] 張媛，譚德講．中國(guó)藥典生物檢定統(tǒng)計(jì)實(shí)例不同計(jì)算方式結(jié)果比較和幾點(diǎn)修改建議[J]．藥物分析雜志2013，33(11)：1858-1861．

ShuangHuangLian preparation quality control study based on the biological titer

LI Mu-rui ZHANG Hui*WANG Cong XU Kai XIONG Xiao-han

College of pharmacy，Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Dalian 116600，China

Objective:Research ShuangHuangLian preparations in vitro antibiotic titer detection method. Establish ShuangHuangLian preparation quality evaluation model based on biological assay. Methods: Under the "Chinese pharmacopoeia" 2010 version of section 2 by cup-plate method of bioassay method, staphylococcus aureus were used for establishing a biological titer evaluation ShuangHuangLian preparation method. determine to different manufacturer ShuangHuangLian oral liquid of antibiotic titer. Results: ShuangHuangLian preparations in vitro antibacterial experiment has a good linear relationship. Different manufacturer ShuangHuangLian oral liquid of antibiotic titer is 10.278-15.7276u. Conclusion: Detection method can be used as a biological titer ShuangHuangLian preparation a method of quality control.

ShuangHuangLian preparation；quality evaluation；biological titer；cup-plate method

國(guó)家科技部中醫(yī)藥行業(yè)科研專項(xiàng)(編號(hào)：201407002)。

李穆睿(1987-)，男，碩士，從事重要質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，E-mail：lmrmars@126.com

張慧(1970-)，女，教授，研究生導(dǎo)師，從事重要品質(zhì)評(píng)價(jià)與創(chuàng)新藥物研究，E-mail:syyycs@163.com

R927.11

A

1007-8517(2015)08-0030-03

2015.01.22)