單增李斯特菌P60單克隆抗體的制備及初步應用

殷 茵，劉 溯，王 芳，朱學亮，周邦信, 駱學農

單增李斯特菌P60單克隆抗體的制備及初步應用

殷 茵1,2，劉 溯3，王 芳2，朱學亮2，周邦信2, 駱學農2

目的 制備并篩選單增李斯特菌P60特異性單克隆抗體，初步建立其快速檢測方法。方法 以體外表達并純化的李斯特菌P60蛋白為抗原免疫Balb/c 小鼠, 采用雜交瘤技術制備抗李斯特菌P60的McAb，鑒定其抗體亞型，并對單抗的腹水效價、穩定性及親和力進行分析。用純化的單克隆抗體包被酶標板，結合生物素化處理的P60多克隆抗體，夾心ELISA篩選單增李斯特菌特異性單抗，并以重組P60為標準品，建立標準曲線。結果 獲得了4株可穩定分泌P60單克隆抗體的雜交瘤細胞株。ELISA檢測表明，篩選的6C2單克隆抗體株可特異性與單增李斯特菌(4b)P60反應。結論 建立的夾心ELISA方法可對單增李斯特菌進行特異性鑒別和定量檢測。

單增李斯特菌；P60；單克隆抗體；鑒定；ELISA

單核細胞增生性李斯特菌(Listeriamonocytogenes, LM) 簡稱單增李斯特菌，是一種能引起人獸共患的食源性致病菌。該菌屬于細胞內寄生的革蘭氏陽性桿菌，人畜感染后，主要表現為腦膜炎、敗血癥和血液中單核細胞增多等癥狀，死亡率達20%～30%[1]。該菌在自然界廣泛存在，食品中存在的單增李斯特菌對人類安全構成很大威脅，是21世紀對人類健康具有重大影響的12種病原微生物之一[2]。

李斯特菌包括單增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、伊氏李斯特菌(L.ivanovii)、無害李斯特菌(L.innocua)、威氏李斯特菌(L.welshimeri)、塞氏李斯特菌(L.seeligeri)。除L.M對人畜致病性高外，其它的都致病力很小或無致病力，而且在自然界中普遍存在。因此，如何區分食品污染的是致病性李斯特菌還是其它常在李斯特菌，是食品工業或動物李斯特菌病免疫學診斷的首要課題。目前，傳統的檢測方法要經過增菌、細菌分離以及生化鑒定等過程，因而所需時間較長，花費人力物力較大，不適合快速檢測的需要。分子檢測技術如PCR、基因探針等分子生物學方法[3-4]，需要昂貴的實驗儀器, 而且特異性差。 因此，不適合在現場對大量樣品進行快速檢測。

國內外一些學者對單增李斯特菌單克隆抗體的制備以及ELISA檢測方法進行了很多研究，但這些研究大都以ActA、LLO等為研究對象。鑒于P60蛋白與李斯特菌侵襲性、免疫原性和種屬分類密切相關。本研究以原核表達的重組P60蛋白為免疫原，制備并篩選出了單增李斯特菌特異性單克隆抗體，初步建立了基于P60的夾心ELISA方法，用于食品及動物產品中單增李斯特菌的特異性檢測。

1 材料和方法

1.1 菌株和細胞 單增李斯特菌(ATCC 19115，19117) 、綿羊李斯特菌(ATCC 19119)、無害李斯特菌(ATCC 51742)、塞氏李斯特菌(ATCC 35967)、維氏李斯特菌(ATCC 35897)均購自美國模式培養物集存庫(American type culture collection)即ATCC公司。重組菌株pET-p60/BL21由本實驗構建并保存，SP2/0骨髓瘤細胞由本實驗室液氮保存。

1.2 實驗動物 Balb/c純系雄性小鼠購自蘭州生物制品研究所，鼠齡6～8周，體重18～22 g，用于免疫和制備飼養細胞；5月齡雌鼠用于制備腹水。

1.3 主要試劑 鎳瓊脂糖凝膠FF蛋白純化回收試劑(北京韋氏博慧)、改良型RPMI 1640培養基、胎牛血清(Hy Clone)、HAT、HT、聚乙二醇( PEG 1500 )、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑(Sigma)，小鼠單克隆抗體亞型檢測試劑盒(Iso Strip)、羊抗鼠IgG-HRP(北京博奧森)、HiTrapTMProtein G HP Columns (GE)。生物素N羥基丁二酰亞胺脂(BNHS)、二甲基甲酰氨(DMF)、辣根過氧化物酶標記的鏈霉素(Sigma)。

1.4 免疫抗原的制備 將攜帶pET-p60質粒的BL21重組菌株37 ℃培養過夜，將菌液按1.0%接種于含卡那霉素(50 μg/mL)的2×YT培養基中，37 ℃劇烈振搖3～4 h，加IPTG(終濃度為1 mmol/L)誘導表達4～5 h。將誘導表達的菌液離心收集菌體，反復凍融及超聲波處理后收集上清，用鎳瓊脂糖凝膠FF純化回收目的蛋白。SDS-PAGE分析重組P60蛋白的純化效果，用Thermo Scientific NanoDrop 2000測定蛋白濃度。

1.5 Balb/ c小鼠的免疫與細胞融合 首次免疫用純化的P60蛋白100 μg加等量弗氏完全佐劑，混勻制成乳劑，皮下注射6～8周齡雌性Balb/c小鼠。此后改用弗氏不完全佐劑乳化抗原，隔21 d進行加強免疫。于融合前3 d，經小鼠腳掌肌肉進行加強免疫。斷尾采血，用間接ELISA檢測小鼠血清抗體效價，選取抗體效價最高的小鼠進行細胞融合。將小鼠骨髓瘤細胞SP2/0與免疫小鼠脾細胞(1∶10)在500 μg/L PEG介導下進行融合。加入含有次黃嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核苷(HAT)的RPMI 1640選擇性培養液，在37 ℃、5%CO2條件下培養，2周后換次黃嘌呤2胸腺嘧啶核苷(HT)培養液繼續培養。

1.6 雜交瘤細胞的克隆與亞型鑒定 將HT培養液中生長的雜交瘤細胞，用有限稀釋法進行克隆化培養。當細胞生長至鋪滿孔底1/ 4～1/ 3 時，用間接ELISA方法進行檢測，選擇陽性值高的單克隆細胞株進行再克隆，直至陽性率達到100 %。間接ELISA操作步驟如下：用P60抗原包被酶標板，每孔100 μL，4 ℃包被過夜。按100 μL/孔加入雜交瘤培養上清液，37 ℃反應1 h ，洗滌3次，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG抗體，每孔100 μL，37 ℃反應1 h，洗滌3 次，再加入底物( OPD) 顯色，每孔100 μL，并用2 mol/L H2SO4終止，每孔50 μL，在酶標儀上測定OD490 nm值。陰性對照孔為1∶200的正常Balb/c小鼠血清，陽性對照孔為1∶200的免疫小鼠血清。

取細胞培養上清液，利用單克隆抗體亞型鑒定試劑盒鑒定單克隆抗體的免疫球蛋白類型及亞型。

1.7 單克隆抗體腹水的制備與效價測定 Balb/c小鼠腹腔注射0. 5 mL液體石蠟(高壓滅菌)，7～10 d 后腹腔注入1×106～5×106個雜交瘤細胞。注射后7～10 d ，可見小鼠腹部明顯膨大，無菌操作采集腹水，1 000 r/ min離心10 min，棄去最上層的脂肪層，收集中間液體層，即為單克隆抗體腹水。 用重組P60抗原包被96孔酶標板，4 ℃過夜，將粗制腹水10倍系列稀釋(1∶10～1∶109)，采用間接EL ISA 測定抗體效價。

1.8 單克隆抗體的物理性質分析 用P60抗原包被酶標板，將腹水按不同比例稀釋，用間接ELISA以進行腹水親和力測定。根據下列公式計算單克隆抗體的親和常數[10]：

AI=[2A1+2/(A1+A2)-1]×100%

上式中A1表示第1 株單抗的OD 490值；A2表示第2株單抗的OD 490值；A1+2表示2 株單抗兩兩疊加后的OD 490值。

取粗制腹水用pH 7.2的PBS做1∶1 000稀釋，置56 ℃水浴中4 h、8 h、12 h、24 h、36 h、48 h，分別用ELISA檢測其OD值的變化，分析單克隆抗體的熱穩定性；同時以pH 2.2的鹽酸和pH9.6的碳酸鹽緩沖液分別對腹水做1∶10稀釋，評價單抗對酸堿的穩定性。

采用飽和硫酸銨沉淀法結合HiTrapTMProtein G HP Columns純化腹水，進行SDS-PAGE分析，Thermo Scientific NanoDrop 2000測定純化后腹水的濃度。

1.9 生物素化多克隆抗體的制備 用純化的P60蛋白免疫家兔，制備P60多克隆抗體。將多抗用飽和硫酸銨沉淀，然后用蛋白G柱進行純化，測定蛋白含量。用DMF將BNHS配成1 mg/mL溶液，再用0.1 mol/L pH9.0的NaHCO3將多抗稀釋至1 mg/mL，按BNHS∶IgG體積比1∶8～1∶15震蕩混勻10 min，室溫靜置3～4 h，將混合物裝入透析袋中4 ℃透析過夜，加入等體積甘油，-20 ℃保存備用。

1.10 夾心ELISA檢測方法的初步建立 分別用100 μL的2E4、3H5和6C2(5F8單抗效價太低)單抗包被酶標板。將L.monocytogenes、L.ivanovii、L.innocua、L.welshimeri和L.seeligeri分別接種BH培養液，過夜培養后離心收集上清作為待檢樣品，分別取100 μL加入已用單抗包被的酶標板中，再加入生物素化的P60多抗，室溫溫育30 min后，加入辣根過氧化物酶標記的鏈霉親合素(Streptavidin)，室溫溫育30 min。加入TMB底物溶液顯色，測定OD450nm的值。根據OD450 nm的值確定僅與L.monocytogenes反應的單抗株。用篩選確定的L.monocytogenes特異性單抗包被酶標板，用純化的重組P60作為標準品溶液(2 000 pg/mL)，倍比稀釋后每孔100 μL分別加入酶標板的反應孔中，再加入生物素化的P60多抗，室溫溫育30 min后，加入辣根過氧化物酶標記的Streptavidin，室溫溫育后加入TMB底物溶液顯色，測定OD450 nm的值。以標準品的濃度為橫坐標，所測OD450 nm為縱坐標繪制標準曲線。根據夾心ELISA所測得的OD450 nm值，從標準曲線即可計算所測樣品中P60蛋白的濃度。

2 結 果

2.1 抗原制備 將表達菌體裂解上清進行SDS-PAGE分析，大約在46 ku的位置有一條濃染的蛋白條帶，與預期分子量一致；鎳瓊脂糖凝膠FF純化后的表達產物經SDS-PAGE分析顯示(圖1)，在46 ku處有單一蛋白帶，表明目的蛋白獲得了較好的純化效果。

M：蛋白質標準分子量；1：誘導表達產物；2:純化后的重組蛋白：

M: Protein marker; 1: pET-P60/BL21 induced by IPTG; 2: Purified recombinant protein.

圖1 P60重組抗原的SDS-PAGE分析

Fig.1 SDS-PAGE analysis of recombined p60 protein

圖2 抗P60單克隆抗體的亞型鑒定

2.2 單克隆抗體亞型鑒定與效價測定 經細胞融合與克隆篩選，共獲得4株P60單克隆抗體雜交瘤細胞，分別為2E4、5F8、3H5和6C2。其中2E4、5F8和6C2為IgG1亞型，3H5為IgG2a亞型。ELISA測定2E4的腹水效價為1∶104，3H5為1∶104，5F8為1∶103，6C2為1∶106(圖2)。

2.3 單克隆抗體物理性質分析 經測定腹水中McAb與包被抗原反應的飽和濃度，2E4和3H5均為10-3，5F8為10-2，6C2為10-5。根據McAb飽和度，用間接ELISA法相加試驗進行4株單抗識別的抗原表位分析，檢測結果見表1。

表1 4株單抗識別抗原表位的分析

注：未標注星號為每株單抗的OD 490值，標星號的為2株單抗兩兩疊加后的OD 490值

Note: Without asterisk numbers represent the value of OD490 for each McAb. The numbers marked with asterisk refer to accumulated value of two McAb.

根據表中數據計算的AI值表明，2E4與3H5識別相同的抗原表位，2E4與5F8識別相同的抗原表位；2E4與6C2識別相同的抗原表位；3H5與5F8識別相同的抗原表位；3H5與6C2識別相同的抗原表位；5F8與6C2識別相同的抗原表位。

4株雜交瘤細胞株的腹水的穩定性均不受熱和堿的影響，但均受酸的影響。

2.4 單克隆抗體腹水純化與濃度測定 純化前后單克隆抗體腹水的SDS-PAGE分析結果見圖3。2E4、3H5和6C2的濃度分別是1.039 mg/ mL，1.190 mg/ mL和5.688 mg/ mL。

M：蛋白質標準分子量；1:2E4腹水；2:純化后的2E4蛋白；3:3H5腹水；4:純化后3H5蛋白；5:5F8腹水；6:純化后5F8蛋白；7:6C2腹水；8:純化后6C2蛋白

M : Protein marker; 1 : 2E4 ascites; 2 : Purified 2E4 protein; 3 : 3H5 ascites; 4: Purified 3H5 protein; 5: 5F8ascites; 6: Purified 5F8 protein; 7: 6C2 ascites; 8 : Purified 6C2 protein.

圖3 單克隆抗體腹水SDS-PAGE電泳分析

Fig.3 SDS-PAGE analysis of the McAbs ascites

2.5 夾心ELISA的初步建立 不同單抗與李斯特菌屬不同成員培養上清的夾心ELISA反應結果表明，三株單抗6C2、3H5和2E4與單增李斯特菌LM4b反應的OD450 nm在0.2以上，而單抗株6C2與其余菌株培養上清反應的OD450 nm均在0.1以下(圖4所示)。說明根據6C2單抗與李斯特菌反應的OD450 nm大小可以區分致病菌(單增李斯特菌)與非致病菌。用重組P60為標準品，倍比稀釋后包被酶標板，以生物素標記的P60多抗和6C2單抗建立的夾心ELISA，測定不同濃度P60所對應的OD450 nm。結果以P60濃度為橫坐標，以OD450 nm為縱坐標繪制的標準曲線(R2=0.992 2)如圖5所示，基本呈一條直線。說明待檢樣品的OD450nm值與待測樣品中P60濃度成正比，可通過建立的標準曲線對待檢樣品進行定量分析。

單增李斯特菌(L.monocytogenes, LM)、綿羊李斯特菌(L.ivanovii, LIV)、無害李斯特菌(L.innocua, LIN)、威氏李斯特菌(L.welshimeri, LW)、塞氏李斯特菌(L.seeligeri, LS)

圖4 四株單抗與李斯特菌屬不同菌株培養上清的夾心ELISA反應

Fig.4 OD value of ELISA of four McAb reacted with culture supernatant from Listeria

圖5 不同濃度P60與夾心ELISA光密度(OD)值間的標準曲線

Fig.5 Plotting P60 standards against the corresponding of the value of OD450

3 討 論

Boerlin[5]等學者用重組的LLO和inl A作為ELISA診斷抗原檢測牛的L.monocytogenes抗體。結果敏感性特異性分別達82%和92%，說明用基因工程生產的抗原建立的ELISA方法可用于L.monocytogenes的診斷和檢測。Vazquez- Boland[6]等用純化的重組溶血素蛋白包被聚苯乙烯板，利用間接ELISA 方法，成功檢測出了綿羊感染的L.monocytogenes。崔煥忠[7]等以致病性李斯特菌ActA蛋白為研究對象，原核表達了ActA 蛋白，制備了抗ActA 特異性單克隆抗體，并從中篩選2株單克隆抗體，分別用于免疫膠體金標記和膠體金試紙檢測線的包被，從而研制成了檢測L.monocytogenes的膠體金試紙條。秦玉敏[8]用純化的重組LLO蛋白免疫小鼠，獲得6株穩定分泌抗LLO單克隆抗體的雜交瘤細胞株，以制備的腹水單抗為診斷抗體，分別與BHI培養基和TSB-YE培養基培養的不同時段的L.monocytogenes上清發生反應，建立了檢測L.monocytogenes的阻斷ELISA方法。但這些方法只能用于L.monocytogenes的定性檢測，而且容易出現假陽性。因為其他非致病性李斯特菌也可能呈現陽性反應。因此，進行致病性和非致病性李斯特菌的鑒別診斷或檢測是非常重要的。

李斯特菌P60蛋白是由入侵相關蛋白(invasion-associated protein,iap)基因編碼的分子量為60 ku的蛋白質，是細胞分裂中非常重要的具有免疫原性的胞壁質水解酶(murein hydrolase)，可大量分泌于培養介質中。因此，P60是開發單增李斯特菌免疫學檢測系統的理想靶標。Yu等[9]篩選了兩株P60單克隆抗體p6007和p6017，分別特異性識別單增李斯特菌和李斯特菌屬的P60蛋白。利用兩株單抗結合P60多克隆抗體，建立了能特異性鑒別單增李斯特菌的夾心ELISA方法。與上述研究相比，本研究用重組蛋白P60抗原免疫小鼠，獲得了4株穩定性較高的單克隆抗體，并從中篩選出了能特異性識別單增李斯特菌P60的單抗。制備重組P60的多克隆抗體，并將其進行生物素化處理，利用生物素(Biotin)-親合素(Avidin)放大系統，大大提高了夾心ELISA檢測的敏感性。同時，通過用重組P60蛋白作為標準品建立的標準曲線，可實現對待檢樣品培養物中P60蛋白的定量檢測。上述研究結果將為建立基于6C2單克隆抗體的夾心ELISA方法，用于單增李斯特菌病的鑒別診斷和食品單增李斯特菌污染的定量檢測奠定了基礎。

[1]Dussurget O, Pizarro-cerda J, Cossart P. Molecular determinants ofListeriamonocytogenesvirulence[J]. Annu Rev Microbiol, 2004, 58(6): 587-610. DOI: 10.1146/annurev.micro.57.030502.090934

[2]Bielecki J. Emerging food pathogens and bacterial toxins[J]. Acta Microbiol Pol, 2003, 52(Suppl): 17-22.

[3]Becker B, Jorda S, Holzapf WH, et al. Rapid and specific detection ofListeriamonocytogenesin smoked salmon with BAX-PCR[J]. Food Ctrl, 2005, 16(8): 717-721.

[4]Xu DS, Shen YH, Yu MH. Development of a rapid,sensitive and specific polymerase chain reaction method for detection ofListeriamonocytogenesin foods[J]. Mod Prevent Med, 2007, 34(16): 3040-3041. (in Chinese) 徐德順, 沈月華, 俞明華. 食品中單核細胞增生李斯特菌PCR快速檢測方法[J]. 現代預防醫學, 2007, 34(16): 3040-3041.

[5]Boerlin P, Boerlin PF, Jemmi T. Use of listeriolysin O and internalin A in a seroepidemiological study of Listeriosis in Swiss dairy cows[J]. J Clin Microbiol, 2003, 41(3) : 1055-1061.DOI: 10.1128/JCM.41.3.1055-1061.2003

[6]Vazquez-boland JA, Dominguez-bernal G, Gonzalez-zorn B, et al. Pathogenicity islands and virulence evolution inListeria[J]. Microbes Infect, 2001, 3: 571- 584.

[7]Cui HZ, Zhang H, Wand XL. Preparation of monoclonal antibody toListeriamonocytogenesand development of colloidal gold strip for detection of the bacterium[J]. Chin Vet Sci, 2010, 40(01): 45-50. (in Chinese) 崔煥忠, 張輝, 王興龍. 單增李斯特菌單克隆抗體的制備及膠體金試紙的研制[J]. 中國獸醫科學, 2010, 40(01): 45-50.

[8]Qin YM. Preparation of Listeriolysin O monoclonal antibodies and preliminary deteetion ofListeriamonocytogenes[D]. Harbin: Department of Preventive Veterinary Medicine, Northeast Agricultural University, 2007. (in Chinese) 秦玉敏. 李氏溶血素單克隆抗體制備及檢測李氏溶血素的初步探索[D]. 哈爾濱: 東北農業大學預防獸醫學系, 2007.

[9]Yu KY, Noh Y, Chung M, et al. Use of monoclonal antibodies that recognize p60 for identification ofListeriamonocytogenes[J]. Clin Diagn Lab Immunol, 2004, 11(3): 446-451.DOI: 10.1128/CDLI.11.3.446-451.2004

Luo Xue-nong, Email: luoxuenong@caas.cn

Monoclonal antibodies againstListeriamonocytogenes

YIN Yin1,2,LIU Su3,WANG Fang2,ZHU Xue-liang2,ZHOU Bang-xin2,LUO Xue-nong2

(1.TianjinCenterForAnimalDiseaseControlandPrevention,Tianjin300402,China; 2.StateKeyLaboratoryofVeterinaryEtiologicalBiology,LanzhouVeterinaryResearchInstitute,CAAS,Lanzhou730046,China; 3.LanzhouInstituteofBiologicalProducts,Lanzhou730046,China)

The aim of this study was to prepare monoclonal antibodies against P60 and develop a double-antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay, which would be used in the detection ofListeriamonocytogenes. The purified recombinant protein of P60, produced by prokaryotic expression, was used to immunize the Balb/c mice. The hybridoma cell lines against P60 were obtained by fusing spleen cells from the immunized mice with mouse Sp2/0 myeloma cells. Specific McAb againstL.monocytogeneswas screened by ELISA. The isotype of the McAb was identified, and then the titers, stability and the affinity of ascites were analyzed. Sandwich ELISA was established using purified ascites and biotinylated P60 polyclonal antibody to detect the p60, which obtained from supernatant ofListeriacultures. The standard curve was established for quantitative determination using the recombinant P60 as the standard against the corresponding the value of OD450. Results showed that 6C2 McAb could be recognized specifically byL.monocytogenes, and the ELISA method based on 6C2 McAb could be used in identification and quantitative detection of samples contaminated withL.monocytogenes.

Listeriamonocytogenes; P60; monoclonal antibodies; identification; ELISA

國家“十一五”科技支撐計劃項目(No.2007BAD40B01)

駱學農，Email:luoxuenong@caas.cn

1．天津市動物疫病預防控制中心，天津 300402; 2.中國農業科學院蘭州獸醫研究所，家畜疫病病原生物學國家重點實驗室，蘭州 730046 3.蘭州生物制品研究所有限責任公司， 蘭州 730046

Supported by the National Science & Technology Pillar Program (No. 2007BAD40B01)

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.06.007

R378.99

A

1002-2694(2015)06-0527-05

2014-12-16；

2015-03-30