海南卷萼兜蘭菌根真菌形態學特征與鑒定*

楊 珺，任軍方，姜殿強，王丹萍，云 勇

(海南省農業科學院熱帶園藝研究所，海口571100)

兜蘭屬為多年生草本植物，是蘭科瀕危類群之一，海南卷萼兜蘭是海南特有的一種蘭花，其株型優美、花朵艷麗、花期較長、具有極高的觀賞價值。目前，卷萼兜蘭的利用整體上仍處于直接從自然界獲取的低級階段，近年來，過度的采挖和環境的惡化使野生資源受到了嚴重破壞。卷萼兜蘭主要繁殖方式是分株繁殖，周期長、且易傷母株，造成卷萼兜蘭組培困難，無菌苗移栽成活率很低的原因是蘭根中沒有形成菌根結構，不能為蘭花的生長提供所需的營養物質。組培苗菌根化是解決瀕危蘭花資源人工栽培的關鍵，因此，研究蘭花與其真菌的結構，探討菌根真菌與蘭科植物之間的相互作用，可以更好地保護、開發和利用海南卷萼兜蘭種質資源。該研究對海南卷萼兜蘭的菌根菌類進行了初步研究，為卷萼兜蘭菌根的深入研究提供參考。

1 卷萼兜蘭菌根真菌的分離

1.1 材料與方法

1.1.1 材料

供試植物：野生卷萼兜蘭植株采集于霸王嶺國家級自然保護區。

培養基及配方：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基 （PDA）：去皮馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂粉20g、水 1 000ml、氯霉素50mg。

1.1.2 方法

分離方法主要參照郭順星等的關于菌根真菌的分離方法，并略做改進。取卷萼兜蘭植株新鮮營養根，清水洗凈，75%酒精消毒30s，NaClO溶液 （2%）消毒分別處理1～12min，無菌水沖洗干凈后置于PDA培養基上，以接種最后一次沖洗的無菌水作為空白對照，于25℃恒溫培養，根段長出菌絲后，挑取邊緣菌絲轉移至另一平板進行純化培養，篩選獲得純菌株后,做好編號記錄，轉移至斜面培養基上保存備用。

1.2 結果與分析

在不同的 NaClO處理中,以 2%NaClO處理 4～6 min為宜，分離結果較為理想，配合以酒精處理時間維持30 s時,分離效果更為明顯。經過多次分離純化后，共得到11種不同分類的真菌菌株，編號為J～01—J～11。

2 菌根真菌的鑒定

2.1 方法

2.1.1 菌落培養特征及形態學觀察

將篩選出的卷萼兜蘭菌株分別接種至PDA培養基，25℃恒溫培養，觀察各菌種的生長情況并記錄菌落特征，包括菌落形狀、大小、正反面顏色、質地以及是否產生色素等情況，挑取長勢良好的菌絲經染色后置于光學顯微鏡下觀察菌絲特征及產孢情況。

2.1.2 真菌生長速率的測定

用直徑0.5cm打孔器在菌絲生長旺盛的菌落邊緣打取菌片，接種于新配好的PDA培養基平板中心，每個菌株3次重復，25℃恒溫培養，隔1天觀察1次，測量并記錄菌落在垂直方向上的直徑，記錄各個菌落長滿整個培養皿的時間，制作菌株的生長速度曲線，其橫坐標和縱坐標分別為培養時間和菌落直徑，以菌落直徑 （cm）除以時間 （天）為真菌菌絲生長速率。

圖1 部分真菌菌株的顯微結構

2.1.3 菌種鑒定

該試驗采用形態學方法對菌根真菌進行初步鑒定，即依據菌株菌落的培養特征、菌株顯微形態觀察及其生長速率的結果，并結合文獻資料綜合分析相關特征的異同，最后確定菌株的鑒定分類。

2.2 結果與分析

2.2.1 菌株培養特征及顯微結構描述

（1）J～01生長速度快，菌落淺白色，長絨毛菌絲，質地疏松，氣生菌絲分叉，邊緣整齊，生長1周后整個菌落墨綠色，菌絲有隔，多次分枝。

（2）J～02正面中間灰綠色，邊緣白色，菌絲短而緊密，表面不平坦，邊緣整齊，背面可見培養基開裂，菌絲有隔，重復多次分枝，排列不規則網狀結構。

（3）J～03菌落呈咖啡色與黃色相間，整個菌落突起，中心菌絲似雪花狀，氣生蓬松，反面墨綠色，邊緣白色，菌絲直角分枝，有隔。

（4）J～04菌落白色，扁平，菌絲短，呈棉狀，菌絲稀疏，培養1周形狀似搶靶心，反面中間橘紅色，有隔菌絲。

（5）J～05菌落棉絮狀，正面淺白色，氣生，疏松，邊緣整齊，背面黃色，培養幾天后菌落表面呈水質狀，同心環圓，顏色不一，菌絲有隔，產生鐮刀狀的分生孢子。

（6）J～06菌落正反面中間呈橘紅色、邊緣米黃色，菌落扁平，菌絲緊密，邊緣菌絲呈絨毛狀，菌落邊緣不整齊，有隔菌絲，銳角分枝。

（7）J～07菌落扁平，菌絲棉絮狀，較緊密，正反面呈白色，邊緣整齊，菌絲有隔，產生大量鐮刀狀的分生孢子。

（8）J～08菌落正反面呈白色，平坦，菌絲較短，緊貼著培養基表面生長，邊緣整齊，菌絲銳角分枝。

（9）J～09菌落正反面中間呈黑色、邊緣白色，菌落表面平坦，菌絲較短，生長月10天后，菌落正面灰綠色，反面藍綠色，菌絲分枝，網狀排列。

（10）J～10菌落正反面呈白色，菌落平坦，形狀不規則，菌絲較短，菌絲有隔，樹枝狀分枝。

（11）J～11菌落正反面乳白色，細絨毛狀菌絲，菌絲稀疏，有隔菌絲，不規則網狀結構排列。

2.2.2 菌株的生長速率

真菌的生長速度是真菌的重要生物學特性之一，不同的菌株在相同的培養基及培養條件下，具有不同的生長速度，測定其生長速率，在真菌的分類鑒定上具有較為重要的意義。該次測定將分離出的11種菌株均接種至PDA培養基上，放置于相同的環境條件下進行培養， 以獲取不同菌株的生長速率，為真菌菌株的鑒定提供依據。菌株PDA培養基上生長速度詳見圖2和圖3。

圖2 部分菌根真菌在PDA培養基上生長速度曲線

圖3 部分菌根真菌在PDA培養基上生長速度曲線

圖4 部分菌根真菌在PDA培養基上生長速度曲線

從圖表中可以看出，除J～01菌株生長迅速與J～10菌株生長較為緩慢外，大多數菌株在10～18天內均可長滿整個培養皿，表明不同的菌株間具有不同的生物學特性，并且各菌株在不同的生長階段里，其生長速度也不完全穩定，這可能與菌種本身的生長機制和培養條件的差異性有關。

2.2.3 菌株形態初步鑒定

該次實驗主要以菌落的形態特征、菌絲、顯微結構及產孢結構為主要鑒定依據，對卷萼兜蘭菌根真菌進行了分類鑒定。對從卷萼兜蘭根中分離出來的11株真菌進行鑒定，初步得出下列結論：在11個供試菌株中，有兩個菌株鑒定結果待定，其余菌根只鑒定到屬，鑒定結果見表1。

表1 菌株鑒定結果

3 討論

表面消毒試劑及不同時長處理,對內生真菌的分離也有很大影響。材料消毒措施的力度 (消毒劑的殺菌力、使用濃度、消毒時間等)越大,滅菌就越徹底,污染力越低。但是消毒劑對植物組織細胞都是有毒的,因此會造成組織細胞損傷嚴重，成活率也就越低。該試驗過程中，表面滅菌采用NaClO較HgCl2溶液的毒性小，且篩選獲得分離效果很好的消毒時間，因此該方法進行表面消毒適用于該材料。由于在相關文獻中報道在根基和根尖中存在的內生真菌較少,所以在取材時也應注意盡量選取根中部的材料做試驗。

分離得到菌根真菌的培養過程觀察發現，卷萼兜蘭內生真菌不同種類的生長情況存在較大差異性。J～01僅3天可長滿整個培養皿，J～10則需26天才會長滿，這可能由真菌本身的生長特性或者這種菌的種群數量決定。可開展卷萼兜蘭的菌根真菌共生萌發和回接實驗，篩選其優勢菌株，對菌根真菌代謝產物進行研究以便深入了解菌根真菌促進蘭科植物生長發育的生理生化機理，為兩者間專一性關系打下基礎。從卷萼兜蘭的根中分離并初步鑒定得到3個菌種屬于鐮刀菌屬，這與相關報道中鐮刀菌占優勢一致，與其他蘭科植物的菌根特征一樣，該鐮刀屬真菌可能為卷萼兜蘭菌根的優勢菌種。

蘭科菌根真菌的分類和鑒定目前還主要依靠形態學方法，該研究分離到的真菌只鑒定到屬而沒有鑒定到種，是因為蘭科植物菌根真菌的鑒定比較復雜，菌根的同源性較高。近年來，分子生物學技術得到了快速發展，很多菌物鑒定工作都引入了分子生物學鑒定方法。分子生物學能夠對形態分類學起到客觀的評價作用，菌根真菌的研究也引入分子生物學的技術手段，傳統的形態學方法和分子手段相結合能將菌株鑒定到種，使鑒定結果更加準確可靠。