LPS誘導小鼠急性肺損傷TLR4及TNF-α表達*

谷志龍 姜華茂 胡占升

急性肺損傷（Acute Lung Injury，ALI）是在創傷、重癥感染、休克等等非心源性疾病過程中，肺泡上皮細胞和肺毛細血管內皮細胞損傷造成的彌漫性肺間質及肺泡水腫，導致的急性低氧性呼吸功能不全或衰竭[1]；脂多糖（LPS）誘導的ALI在重癥感染后早期出現[2]，并且死亡率較高[3]。Toll like receptors（TLRs）家族和先天性免疫系統關系比較密切[4]，其中TLR4目前研究最多，是LPS受體[5]。本實驗基于建造小鼠內毒誘導ALI[6-7]，深入探討ALI、LPS和TLR4及TNF-α之間的關系及損傷機制，并可能為臨床ALI的預防和治療提供實驗基礎和新方法。

1 材料與方法

1.1 主要材料、儀器及試劑 DNA marker（大連寶生物）和引物（大連寶生物），梯度PCR儀器（德國Biometre公司），超凈工作臺（蘇州凈化設備廠），DU800核算蛋白分析儀（德國BECKMAN COULTER公司），半干式轉膜儀，辣根標記羊抗兔二抗（北京中杉金橋）兔抗小鼠TLR4抗體（SANTA），DNA及蛋白maker（大連寶生物），引物（大連寶生物）。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物及分組 SPF級別的BALB/C雄性小鼠，體重30~35 g，隨機分成3組，每組10只，A組為正常對照組，不作任何處理；B組為急性肺損傷模型組：腹腔內注射給予LPS（4 mg/kg）腹腔內注射制備ALI模型；C組為抗體組：建造ALI模型前8~10 h給予TLR4/MD腹腔內注射（50 μg）。在建造模型成功后各組小鼠無菌條件下取出肺組織和取小鼠血檢測內毒素及TNF-α水平，一部分肺組織置于液氮冷凍后，在-80 ℃冰箱保存，為mRNA及蛋白表達的檢測，另外部分放置在4%多聚甲醛內固定24 h后，HE染色鏡下觀察小鼠肺組織形態改變。

1.2.2 實驗指標檢測及試驗方法

1.2.2.1 小鼠血內毒素含量檢測 選用試劑盒（動態濁度法-血漿內毒素檢測試劑）的處理方法和步驟，處理血標本，并應用LPS監測分析得出檢測數據。

1.2.2.2 小鼠肺組織HE染色及形態改變 4%多聚甲醛中固定，浸潤、經過梯度脫水，透明化處理（二甲醛），石蠟包埋處理，各組切片6張，厚度約7 μm，HE染色后，光學顯微鏡下觀察形態及病理變化；損害評分標準應用Gloor等[8]方法。

1.2.2.3 小鼠肺組織TLR4基因表達 按照TAKALA說明書進行提取總RNA。TLR4基因表達：通過分光光度儀測RNA280 nm/260 nmOD值，立即開始進行逆轉錄，合成cDNA，引物序列（TLR4），上游 5’-CCCTGAAAGGCTTGGTCT-3’；下游3’-GAGGTGTCHHTHHTCTAA-5’，擴增產物長度268 bp；引物序列（β-actin），上游 5’-AGGCATACAGGGACAGCA-3’；下游 3’-TACAGCAGGGTCAACCATTG-5’， 擴增產物長度 534 bp。反應體系：10×RT Buffer 1 μL，MgCl22 μL，AMV逆轉錄酶0.5 μL，RNase Inhibitor 0.25 μL，Oligo dT 0.5 μL，RNase FREE dH2O 3.75 μL，dNTP Mixture 1 μL，Total RNA 1 μL。 反 應條件：32 ℃ 9 min，49.2 ℃ 32 min，97 ℃ 4 min，4 ℃ 4 min。cDNA為模板PCR擴增，反應體系：5×PCR Buffer 10 μL，MgCl22 μL，dNTP Mixture 1 μL，cDNA 2 μL，上下游引物各 1 μL，H2O 32.75 μL，Taq酶 0.25 μL；反應條件：96 ℃6 min、（95 ℃ 30 s、49.2 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s）33 cycle、72 ℃9 min。

1.2.2.4 小鼠肺組織TLR4蛋白表達 取小鼠肺組織進行總蛋白的提取，提取后用BCA法進行蛋白含量的檢測，檢測后進行PAGE凝膠電泳，電泳分離60 min后，通過maker條帶選取約95 kd大小切膠，應用半干轉膜方法，封閉60 min，經過一抗、二抗孵育，ECL顯色，暗室內曝光，Tannon Gis軟件分析測曝光底片光密度值。

1.2.2.5 小鼠血漿TNF-α雙抗夾心ELISA檢測 通過應用ELISA檢測TNF-α試劑盒方法與流程進行標本處理及檢測，并在酶標儀進行檢測分析。

1.3 統計學處理 應用SPSS 17.0軟件進行統計學分析，計量資料以（±s）表示，各組的均數采取單因素方差分析，組間進行兩兩比較LSD檢驗，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 建模小鼠情況 各組小鼠觀察情況如下：A組無死亡小鼠，B組小鼠攻毒后最初僅異常活動增多，隨后出現蜷縮、抱團現象，刺激無反應，不能進食、水，腹部呼吸頻率快，死亡1只；C組小鼠變化同A組。

2.2 LPS含量檢測 和A組比較，B組（模型組）LPS水平顯著升高，C組LPS水平也呈現升高趨勢，建模成功，見表 1、圖 1。表3、圖4、圖5。

表1 各組小鼠血漿內毒素水平

圖1 各組小鼠血漿內毒素水平

表3 各組小鼠TLR4 mRNA及Protein表達

2.3 小鼠肺組織HE染色鏡下觀察 小鼠攻毒造模后，鏡下肺泡水腫及腔內紅染，肺泡間隔增厚并充血，視野可見大量中性粒細胞浸潤。抗體組干預后小鼠肺組織狀況明顯改善，鏡下僅少量中性粒細胞浸潤，肺泡及間隔水腫不明顯，見表2、圖2、圖3。

表2 各組小鼠肺組織病理學評分

圖2 各組小鼠肺組織HE染色鏡下改變（×200）

圖3 各組小鼠肺組織病理學評分

2.4 各組小鼠TLR4基因的表達 A組小鼠（正常對照組）肺組織內僅有少量TLR4 mRNA表達。與A組比較，B組（模型組）TLR4 mRNA表達明顯上調（P<0.05），C組（抗體組）和B組比較，TLR4 mRNA表達呈下調（P<0.05），見

圖4 TLR4 mRNA表達

圖5 TLR4 mRNA及Protein表達結果

2.5 各組小鼠TLR4蛋白的表達 A組小鼠（正常對照組）肺組織內僅有少量TLR4 Protein表達。與A組比較，B組（模型組）TLR4 Protein表達明顯上調（P<0.05），C組（抗體組）和B組比較，TLR4 Protein表達呈下調（P<0.05），見表4、圖5、圖6。

表4 各組小鼠TLR4 Protein表達

圖6 TLR4 Protein表達

2.6 各組小鼠TNF-α檢測 TNF-α水平變化同TLR4 mRNA和Protein趨勢相同。C組（抗體組）的TNF-α水平明顯低于B組（模型組），差異有統計學意義（P<0.05），見表5、圖7。*與A組比較，P<0.05；#與B組比較，P<0.05

表5 各組小鼠TNF-α表達（x-±s）

圖7 TNF-α表達

3 討論

ALI/ARDS病死率極高，其致病原因主張分直接肺損傷和間接肺損傷[9]。直接肺損傷因素：誤吸，重癥肺炎，肺挫傷，再灌注及淹溺等；間接肺損傷因素：嚴重創傷伴休克，膿毒癥及大量輸血制品等[10]。LPS水平在導致ALI病死率高達70%~90%[11-12]，以往研究認為，炎癥調控的強弱是NF-kB，其受LPS、缺氧、創傷等多種因素啟動[13-14]，誘導多種細胞因子（如IL1、IL4、IL6、IL8、PAF）、黏附分子急性期反應蛋白等進行下游表達，從而產生一系列的SIRS生物學效應。TLR4是先天性免疫系統識別病原微生物主要受體，為LPS主要受體[15]。近年，對于TLRs家族成員與疾病的關系研究愈發收到關注、尤其是TLR4[16]。

本實驗動物模型制備簡單，可控性腔，重復率較高，同人類急性肺損傷相似。和正常對照組比較，模型組TLR4 mRNA、Protein及TNF-α表達明顯上調，提示ALI發生機制可能和TLR4及TNF-α相關。和模型組比較，抗體組的TLR4介導LPS信號通路表達下調，從而使炎性介質、細胞因子等減少，TNF-α水平下調，喪失了對LPS的反應性，進而產生耐受，故通過阻斷TLR4信號靶點的表達，降低其下游TNF-α水平，能夠增加LPS耐受性的產生和LPS導致的ALI。既往研究熱點主要是NF-kB、NO、IL1、黏附因子等下游分子的啟動，而本實驗從LPS受體蛋白TLR4作為研究靶點，實驗表明TLR4是控制ALI的瀑鏈式SIRS的門戶蛋白。

綜上所述，膿毒血癥導致ALI，通過腹腔內注射LPS動物模型復制性較好；其損傷機制可能是LPS和TLR4受體結合，介導TNF-α信號途徑導致。通過干預TLR4受體靶點能夠下調TNF-α，減輕臨床癥狀，這位臨床對于膿毒血癥所致ALI提供新的治療思路和實驗基礎。

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