復發性流產與宮頸HPV感染的相關性分析*

鐘小敏

復 發 性 流 產（Recurrent spontaneous abortions，RSA）是指與同一性伴侶連續發生2 次或2 次以上的自然流產[1-2]。其病因復雜，主要包括免疫、感染、遺傳、環境、內分泌、血栓前狀態等因素，部分患者原因不明[3]。流行病學資料顯示RSA發生率約為15-40%，2次或2次以上的流產約占生育期婦女的2%~4%，而3次或3次以上的復發性流產約為1%~2%，且近年來伴隨著生活習慣、飲食結構的不斷變化，RSA的發病率逐年增加。近年研究表明，RSA約50%~60%與免疫紊亂有關，同時感染因素也占相當大比重，但由于各種病原體對胚胎毒性的作用不確切，故感染與RSA的關系最受爭議[4]。目前國內外關于RSA與HPV感染的關系報道較少。盧銀平等[5]對RSA孕婦流產組織的研究發現，人細小病毒B19感染可能與RSA發生密切相關。姚守珍等[6]對RSA病毒E-鈣黏素及HPV相關性后發現RSA患者中E-鈣黏素陽性率顯著低于非RSA患者，HPV感染的陽性率顯著高于RSA感染患者，其認為RSA與HPV感染有一定的相關性。為更好的探討RSA與HPV感染的相關性，本文選取了較大樣本的RSA患者與非RSA患者進行對照研究，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 將本站婦科門診就診的早期復發性流產（RSA）98例患者作為實驗組，排除標準：子宮畸形、宮內（細菌、真菌、原蟲等）感染、內分泌及夫婦染色體異常，以及既往有自身免疫性疾病史；選取同時期妊娠的非RSA女性95例為對照組，入選標準為：診斷為早孕、非意愿正常妊娠要求終止妊娠，排除標準同RSA患者。RSA診斷標準為：與同一性伴侶連續遭遇2次或2次以上在20周妊娠前或胎兒丟失（體重≤500 g）。實驗組患者年齡22~35歲，平均（28.9±4.7）歲，孕周5+2~12+4周，平均（7.1±3.6）周，孕次3~7次，流產2~6次。對照組患者年齡24~37歲，平均（29.2±5.1）歲，孕周4+6~12+2周，平均（6.9±3.7）周，孕次1~5次，流產0~4次。兩組患者的年齡、孕周比較差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 實驗室取材 觀察組在確認胚胎停止發育，對照組于人工流產時進行取樣，取樣時采用棉拭子輕輕拭凈宮頸口過多的分泌物，再用宮頸刷，在宮頸管內鱗柱上皮交界處采樣，采樣時稍用力轉動數周，取得宮頸脫落細胞，放入有專用細胞保存液的試管中采集標本密閉，并在2 h內保存于4 ℃冰箱中，在48 h內進行下一步檢查。

1.3 基因檢測 采用導流雜交基因芯片技術，進行23種（18種高危型和5種低危型）HPV基因型的檢測。主要步驟：（1）樣本處理及HPV-DNA提取和富集：將選取的細胞樣本加入預先配置的細胞消化液釋放細胞DNA。（2）HPV-PCR擴增：選擇HPVl基因區共有引物GP5+/GP6+和β-globin基因引物Glob-F/Glob-R對所有標本進行PCR 檢測，后選用改進MY09/11共有引物（PGMY09/11）對所有β-Globin陽性而HPV陰性的標本進行二次擴增，檢測HPV-611，16，18，30，31，33，35，45，51和52，采用目的基因的量/內參基因的量消除樣本間的擴增效率差異，每管樣本重復測量3次。PCR擴增程序設定，溫度變化設定：95 ℃ 10 s， 95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，75 ℃ 10 s，共進行40個循環，溫度變化速率20 ℃/s。

1.4 觀察指標 （1）比較兩組人群的HPV各亞型分布情況；（2）將HPV16、HPV18作為HPV感染的高危組，HPV33、HPV58、HPV31作為低危組[7]，比較兩組人群的高危及低危比例；（3）將HPV感染與RSA進行相關性分析。

1.5 統計學處理 數據處理采用SPSS 17.0統計學軟件，計數資料采用百分率表示，采用 字2檢驗，相關性分析采用Spearman方法，以P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HPV感染情況 實驗組中HPV陽性34例（34.7%），對照組HPV陽性12例（12.6%），實驗組HPV陽性率顯著高于對照組（ 字2=16.186，P<0.001）。實驗組HPV陽性中HPV33、HPV58、HPV31、HPV18亞型所占例與對照組HPV陽性占各亞型比例比較差異均無統計學意義（P>0.05），HPV16亞型在實驗組比例顯著高于對照組（P<0.05）。見表1。

表1 兩組人群HPV亞型的分布情況 例（%）

2.2 HPV低危與HPV高危感染情況 實驗組中HPV高危比例顯著高于對照組（P<0.001）。見表2。

表2 RSA感染的HPV低危與HPV高危的感染情況 例

2.3 HPV感染與RSA相關性分析 HPV陽性與RSA發生呈正相關性（r=0.259，P<0.001）。

3 討論

復發性流產的治療可謂醫學界的一大“難題”，其病因復雜，部分患者病因不清。其中約50%~60%與免疫紊亂有關，同時感染因素也占相當大比重，但由于各種病原體對胚胎毒性的作用不確切，故感染與RSA的關系最受爭議。HPV是目前已明確的與宮頸病變有關的病原體，最近報道，城市醫院門診患者HPV感染率高達21.82%，但僅少數轉變為持續性感染，發展為CIN，甚至進展為浸潤癌，在這一過程中，宿主的免疫反應對HPV感染的轉歸起著決定性作用。有關HPV感染與RSA的關系，國內僅1例報道HPV可能參與了復發性流產的過程，國外研究結果尚存爭議。故對妊娠早期RSA女性HPV感染的發生率和基因型的分布與非RSA者進行比較分析，探討HPV感染與RSA的關聯性，對于RSA患者的診斷及預防提供新的方向，提升RSA患者的預后有重要的價值。

研究資料顯示，HPV的主要易感因素為：性伴侶多且不固定、過早性生活、遺傳、激素、生活環境等，其中宿主的免疫功能狀況起著十分重要的作用。在年輕婦女中，HPV感染普遍存在，多可自然緩解，僅少數轉變為持續性感染，發展為CIN，甚至進展為浸潤癌[8]。王莉等[9]認為，宿主免疫反應對HPV感染的轉歸起著決定性作用。基于RSA和HPV感染均與免疫功能狀態密切相關性，以及感染因素在RSA發生中所占的重要比重，RSA與HPV的可能相關性受到更多學者的關注。Hermonat等[10]首先發現，在自然流產組織中HPV感染率明顯高于人工流產者，認為自然流產的發生可能與HPV感染有關。而Skoczyński等[11]報道，在RSA 的流產組織中與足月分娩胎盤中，HPV感染率并沒有顯著差異，但需要大樣本研究進一步證實。Weyn等[12]發現了HPV存在于胎盤組織中的證據，認為HPV可以通過宮頸或受感染的精液而上行性感染，間接推測宮頸HPV感染者自然流產率可能高于非感染者。

本文的研究中采用的DNA分析方法為熒光定量PCR方法，其是指在PCR的反應體系中通過添加熒光，利用熒光信號積累實時的實現監測整個PCR的進程，目前臨床上包含有2種熒光體系，其一為在反應中通過使用插入性熒光材料如，SYBR Green，加入該染料后，DNA模板可結合到雙鏈DNA上并出現熒光，未結合的SYBR Green則不能發出熒光，另一種方法為使用熒光標記的寡核苷酸探針，通過探針結合到靶向序列上，通過探針與靶序列作用發出熒光。本研究即通過該種方法實現HPV分型診斷的目的。本文的研究中對RSA患者與非RSA患者的HPV感染情況進行基因檢測后發現實驗組中HPV陽性34例，占比34.7%，非RSA組HPV陽性12例，占比12.6%，實驗組HPV陽性率顯著高于對照組（ 字2=16.186，P<0.001）。提示RSA患者HPV的感染率顯著高于非RSA患者，RSA的發生與HPV感染可能有密切關聯。在對RSA與非RSA患者HPV感染各亞型占HPV感染陽性比例進行對比后發現，RSA患者的HPV陽性中各HPV33、HPV58、HPV31、HPV18例與非RSA患者HPV陽性占各亞型比例比較無統計學差異（P>0.05），HPV16亞型在RSA患者中比例顯著高于非RSA患者（P<0.05），提示HPV16感染亞型可能為引發RSA的高危型。吳意等[13]在對HPV引發宮頸癌病理進行研究后發現，宮頸癌患者中HPV病變率高達18.29%，其中HPV16占比高達44.3%，且HPV16在低度宮頸鱗狀上皮內病變（LSIL）、高度宮頸鱗狀上皮內病變（HSIL）宮頸癌的檢出率均為最高，依次為25.29%、57.14%、75.00%，提示HPV16感染可能在高危型子宮病變的發生及發展中起重要作用。目前關于HPV感染引發RSA的確切病理機制尚不明確，Boulenouar等[14]對HPV16 E5、E6、E7質粒轉染體外培養的絨毛癌BeWo細胞證，HPV16可有效抑制BeWo、E-cadherin基因的表達。姚守珍等[6]研究發現，HPV1感染陽性的孕婦E-鈣黏素陽性率研究組為35.71%，非RSA患者陽性表達率為100%，E-鈣黏素的陽性表達被認為是妊娠期滋養細胞合成的重要物質，E-鈣黏素表達抑制常引發流產[15]。本文的研究還發現HPV感染與RSA存在正相關性（r=0.259，P<0.001），但相關強度較低，分析原因可能與RSA發病的其他因素，如生活環境、不良生活習慣、遺傳等因素有關。

總之，RSA與HPV感染關聯密切，RSA患者中宮頸HPV感染比例顯著高于非RSA患者，但關于RSA與HPV感染的確切關系有待于臨床大樣本、多中心對照研究及基礎病理學進行深入探討。

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