藤椒油的抑菌活性及其穩(wěn)定性研究

周 婷,蒲 彪,姜?dú)g笑,劉春燕

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院,四川雅安 625014)

藤椒油的抑菌活性及其穩(wěn)定性研究

周 婷,蒲 彪*,姜?dú)g笑,劉春燕

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院,四川雅安 625014)

為了解冷榨藤椒油和溶劑萃取的藤椒油的抑菌活性和抑菌穩(wěn)定性,通過濾紙片法和試管二倍稀釋法測(cè)定了藤椒油對(duì)3種常見細(xì)菌及3種酵母菌的最低抑菌濃度和最低殺菌濃度,采用生長速率法測(cè)定對(duì)2種霉菌的抑制作用,并以枯草芽孢桿菌和膠紅酵母為指示菌,探討了介質(zhì)pH、熱處理及紫外照射對(duì)兩種藤椒油的抑菌穩(wěn)定性的影響。結(jié)果表明,藤椒油對(duì)8種受試菌均有抑制效果,其中溶劑浸出油的抑菌效果強(qiáng)于冷榨油的。

藤椒油,抑菌活性,穩(wěn)定性

藤椒(ZanthoxylumarmatumDC Prodr.)是蕓香科花椒屬下的花椒亞屬,是我國花椒品種中的一個(gè)優(yōu)良品種,具有獨(dú)特的麻香風(fēng)味。它不僅是著名的油料、香料,也是一種中藥材。鮮藤椒果實(shí)萃綠色,布滿凸點(diǎn),含油豐富,但是不耐貯藏,因此常制成藤椒油。近年來,四川洪雅藤椒油作為調(diào)味料已形成獨(dú)特的“藤椒菜品”系列[1-3]。

花椒屬植物主要活性成分為揮發(fā)油、生物堿類化合物、酰胺類化合物、生物堿和黃酮類物質(zhì)等。花椒作為一種傳統(tǒng)中藥,具有治療嘔吐、腹瀉,鎮(zhèn)痛,抗腫瘤等功效,在抑菌殺蟲、抗炎等方面也具有較強(qiáng)的藥理活性[4-5]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)冷榨藤椒油和溶劑浸出油的抑菌作用和抑菌穩(wěn)定性進(jìn)行了初步研究,以期為今后藤椒油應(yīng)用于天然防腐工業(yè)提供科學(xué)參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

冷榨藤椒油(2013年7月21號(hào)生產(chǎn))和鮮藤椒(2013年7月21號(hào)于四川省洪雅縣采集),由四川洪雅縣幺麻子食品有限公司提供;用冷榨技術(shù)生產(chǎn)的藤椒油稱冷榨油,用溶劑萃取的藤椒油稱溶劑浸出油。

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、膠紅酵母(Rhodotorulamucilaginosa)、畢赤酵母(Pichiagaleiformis)、清酒假絲酵母(Candidasake)四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。黑曲霉(Aspergillusniger)、黃曲霉(Aspergillusflavus)購自廣東省微生物菌種保藏中心。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(用于細(xì)菌培養(yǎng))、YEPD培養(yǎng)基(用于酵母菌培養(yǎng))、察氏培養(yǎng)基(用于霉菌培養(yǎng))。

SW-CJ-IF單人雙面超凈工作臺(tái) 蘇凈安泰空氣技術(shù)有限公司;YXO.SG41.280高壓蒸汽滅菌鍋 上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司;500WHHS-2S電子恒溫不銹鋼水浴鍋 上海光地儀器設(shè)備有限公司;PYX-DHS-60×75電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司;DHG-9245A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 溶劑浸出油的提取 以無水乙醚為提取溶劑,采用回流提取法[6]。

1.2.2 藤椒油對(duì)細(xì)菌、酵母菌的抑菌實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 菌種活化和菌懸液制備 將實(shí)驗(yàn)所用菌種接種在新鮮的斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行活化,活化兩次,細(xì)菌37℃下培養(yǎng)24h,酵母菌28℃下培養(yǎng)48h。活化后的菌種用接種環(huán)挑取少量菌落至無菌生理鹽水中,采用平板計(jì)數(shù)法,將菌懸液濃度調(diào)至106～107cfu/mL[7],備用。

1.2.2.2 藤椒油溶液的制備 以丙酮做溶劑,分別制備100mg/mL冷榨油溶液和100mg/mL溶劑浸出油溶液,并用0.22μm微孔過濾器過濾,備用。

1.2.2.3 抑菌圈測(cè)定 采用濾紙片法,取無菌培養(yǎng)皿,迅速倒入滅菌后冷卻至45℃左右的培養(yǎng)基15～20mL,冷卻凝固后倒置備用。從菌懸液中各取100μL加入到已經(jīng)冷卻好的培養(yǎng)基上,用滅菌涂布棒將其涂布均勻。將滅菌濾紙片(d=6mm)貼于牛肉膏、YEPD培養(yǎng)基上,用移液槍各取20μL 藤椒油溶液吸附于濾紙片上。平板放入冰箱冷藏30min,細(xì)菌37℃下培養(yǎng)24h,酵母菌28℃下培養(yǎng)48h,觀察各個(gè)培養(yǎng)皿中菌的生長情況,用十字交叉法測(cè)量抑菌圈的直徑(包括濾紙片直徑),每菌重復(fù)三次,取平均值。以丙酮為對(duì)照(CK),每個(gè)平板用筆把平板以圓心為中心劃出5個(gè)均勻的扇形,放置5片濾紙[8]。

1.2.2.4 藤椒油最低抑菌濃度(MIC)的測(cè)定 采用試管二倍稀釋法,各取10支滅菌試管,取1mL相應(yīng)液體培養(yǎng)基于每支試管中,分別取1mL藤椒油溶液(100mg/mL)于每組的第1支試管內(nèi),混勻,從每組第1管吸取1mL混勻到每組第2管中,依次類推直到第9管,再從第9管吸取1mL混勻液去掉,第10支試管為不含藤椒油溶液的對(duì)照組。依次配成藤椒油質(zhì)量濃度為50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625、0.78125、0.39063、0.19531、0mg/mL培養(yǎng)基試管,各加入菌懸液100μL,另取9支試管,稀釋步驟按上述進(jìn)行,此組不加菌液作為藤椒油溶液對(duì)照組。試管置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng),細(xì)菌37℃下培養(yǎng)24h,酵母菌28℃下培養(yǎng)48h,根據(jù)試管內(nèi)液體的渾濁度判定藤椒油的MIC值(液體澄清,表示無菌生長)[9-10]。

1.2.2.5 藤椒油最低殺菌濃度(MBC)的測(cè)定 將1.2.2.4中測(cè)出的MIC及以上濃度的培養(yǎng)基表面用無菌生理鹽水沖洗,接種到相應(yīng)的素瓊脂培養(yǎng)基上,用滅菌涂布棒涂布均勻,細(xì)菌37℃下培養(yǎng)24h,酵母菌28℃下培養(yǎng)48h,觀察并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果,無菌生長的最低濃度即為該物質(zhì)的最低殺菌濃度。重復(fù)上述過程3次,取平均值。

1.2.3 藤椒油對(duì)霉菌的抑菌實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 菌種活化及菌餅制備 首次活化將黑曲霉、黃曲霉在試管斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)7～10d,二次活化培養(yǎng)7d,用無菌水洗下孢子,得到孢子懸浮液。將孢子懸浮液均勻涂布在察氏培養(yǎng)基上,28℃培養(yǎng),待菌絲長滿培養(yǎng)皿時(shí),4℃冷藏,備用。用時(shí)打孔即可。

1.2.3.2 藤椒油對(duì)霉菌菌絲生長的抑制率 采用菌絲生長速率法,各取100mg/mL的藤椒油溶液依次稀釋成50,25,12.5,6.25,3.125mg/mL的母液。在無菌條件下,按一定比例29∶1(培養(yǎng)基∶樣品溶液)與溫度在45℃左右的察氏培養(yǎng)基混勻,制成帶毒培養(yǎng)基。以丙酮代替樣品溶液作為對(duì)照。冷卻后,用打孔器(5mm)打取菌餅,取菌落邊緣生長旺盛的菌絲,然后用接種針挑取菌餅置于帶毒培養(yǎng)基中央,菌絲面朝下,于28℃下培養(yǎng),72h后采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑(含菌餅直徑)[11-12],實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,用下式計(jì)算菌絲生長的抑制率:

抑制率(%)=(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對(duì)照菌落直徑-菌餅直徑)]×100

1.2.3.3 藤椒油對(duì)霉菌的半抑制濃度(IC50) 將抑制百分率換算成抑制幾率值,以藤椒油濃度對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo),抑制幾率值為縱坐標(biāo),采用Origin Pro 8.6求出毒力回歸方程式和霉菌菌絲生長的半抑制濃度(IC50)。

1.2.4 藤椒油抑菌穩(wěn)定性研究 以枯草芽孢桿菌和膠紅酵母為指示菌[13-15]。

1.2.4.1 介質(zhì)pH對(duì)藤椒油抑菌活性的影響 分別用0.1mol/L HCl和0.1mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)液體培養(yǎng)基的pH,制成pH分別為3.0、5.0、7.0、9.0、11.0的培養(yǎng)液,以未調(diào)pH的培養(yǎng)液作為對(duì)照。采用試管二倍稀釋法測(cè)定MIC。

1.2.4.2 熱處理對(duì)藤椒油抑菌活性的影響 分別將100mg/mL的藤椒油溶液置于60、80、100℃水浴及121℃濕熱條件下處理30min,以未加熱處理的樣品作為對(duì)照。采用試管二倍稀釋法測(cè)定MIC。

1.2.4.3 紫外照射對(duì)藤椒油抑菌活性的影響 分別將100mg/mL的藤椒油溶液在紫外燈(254nm)下照射10、20、30、60min,以未經(jīng)紫外照射的樣品為對(duì)照。采用試管二倍稀釋法測(cè)定MIC。

2 結(jié)果與討論

2.1 藤椒油對(duì)細(xì)菌、酵母菌的抑菌效果

2.1.1 藤椒油抑菌活性的測(cè)定 抑菌活性差異顯著性分析如表1所示。

從表1可以看出,冷榨油和溶劑浸出油在相同質(zhì)量濃度(100mg/mL)下,對(duì)枯草芽孢桿菌和膠紅酵母有明顯的抑制作用,對(duì)其他四種供試菌也有抑制作用,但是其抑制作用相對(duì)較弱一些;對(duì)比兩種提取工藝藤椒油的抑菌效果,可以看出兩種藤椒油除對(duì)清酒假絲酵母抑菌效果差異沒有顯著性外,對(duì)其他5種供試菌的抑菌效果差異顯著,且溶劑浸出油抑菌效果強(qiáng)于冷榨油。

2.1.2 藤椒油MIC測(cè)定結(jié)果 表2的MIC進(jìn)一步證實(shí)了兩種藤椒油對(duì)不同供試菌具有不同的抑菌效果,且溶劑浸出油對(duì)6種供試菌的抑制效果明顯強(qiáng)于冷榨油。溶劑浸出油對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制效果最好,MIC為0.78125mg/mL,其次為膠紅酵母、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌,MIC為1.5625mg/mL,對(duì)畢赤酵母和清酒假絲酵母抑制效果最弱,MIC為3.125mg/mL;冷榨油對(duì)枯草芽孢桿菌和膠紅酵母抑制效果最好,MIC為6.25mg/mL,對(duì)其他四種供試菌的MIC達(dá)到12.5mg/mL。

表1 藤椒油抑菌效果測(cè)定結(jié)果(抑菌圈直徑單位:mm)Table 1 The results of antibacterial activity ofZanthoxylum armatum DC Prodr. Oil (diameter of inhibition zone:mm)

注:同行星號(hào)*表示兩種油的抑菌效果差異顯著(p<0.05)。

表2 藤椒油對(duì)不同供試菌的MIC比較Table 2 MICs of Zanthoxylum armatum DC Prodr. Oil against bacteria and yeasts

表4 藤椒油對(duì)霉菌的抑制率(%)Table 4 The inhibitoty rates of Zanthoxylum armatum DC Prodr. Oil(%)

注:同行星號(hào)*表示差異顯著(p<0.05),**表示差異極顯著(p<0.01)。

表5 藤椒油對(duì)霉菌的半抑制濃度(IC50)Table 5 IC50values of Zanthoxylum armatum DC Prodr. Oil on mould(IC50)

2.1.3 藤椒油MBC測(cè)定結(jié)果 從表3 MBC值可知,溶劑浸出油對(duì)枯草芽孢桿菌和膠紅酵母殺菌效果最好,MBC為3.125mg/mL,其次為畢赤酵母和清酒假絲酵母,MBC為6.25mg/mL,對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌殺菌效果最弱,MBC為12.5mg/mL。而冷榨油對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌兩種細(xì)菌和酵母菌殺菌的作用效果相差不大,MBC為12.5mg/mL,對(duì)金黃色葡萄球菌的殺菌效果最弱,MBC達(dá)到25mg/mL。

表3 藤椒油對(duì)不同供試菌的MBC比較Table 3 MBCs of Zanthoxylum armatumDC Prodr. Oil against bacteria and yeasts

2.2 藤椒油對(duì)霉菌的抑菌效果

2.2.1 藤椒油對(duì)霉菌抑制作用 由表4可見,兩種藤椒油對(duì)黑曲霉和黃曲霉具有不同的生物活性,相同質(zhì)量濃度下,溶劑浸出油對(duì)黑曲霉和黃曲霉的抑制作用強(qiáng)于冷榨油,且其抑制作用隨質(zhì)量濃度的增大而增強(qiáng),其中在12.5～50mg/mL范圍內(nèi),溶劑浸出油對(duì)黃曲霉的抑制作用比對(duì)黑曲霉強(qiáng),在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi),冷榨油對(duì)黑曲霉的抑制率卻遠(yuǎn)高于對(duì)黃曲霉的。在濃度為50mg/mL時(shí),溶劑浸出油對(duì)黑曲霉的抑制率為70.30%,而對(duì)黃曲霉的抑制率高達(dá)80.38%;在相同質(zhì)量濃度下,冷榨油對(duì)黑曲霉抑制率達(dá)到76.24%,對(duì)黃曲霉僅為63.02%。差異顯著性分析顯示,在25～50mg/mL范圍內(nèi),溶劑浸出油與冷榨油對(duì)黑曲霉的抑制作用差異不顯著,在12.5mg/mL時(shí)差異顯著,在3.125～6.25mg/mL范圍內(nèi),差異極顯著。而對(duì)黃曲霉的抑制作用在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi),兩種油的抑菌效果差異極顯著。結(jié)果表明,兩種藤椒油對(duì)黑曲霉和黃曲霉具有較好的抑菌活性。

2.2.2 藤椒油對(duì)霉菌的半抑制濃度(IC50) 由表5可知,兩種藤椒油對(duì)黑曲霉和黃曲霉均具有很好的抑制作用,尤其是溶劑浸出油,對(duì)黑曲霉和黃曲霉的IC50分別為0.0829、0.547mg/mL,均低于冷榨油相應(yīng)的IC50值。

2.3 藤椒油抑菌穩(wěn)定性

2.3.1 介質(zhì)pH對(duì)藤椒油抑菌活性的影響 由表6、表7可知,介質(zhì)pH對(duì)藤椒油抑菌活性具有一定的影響,堿性條件下溶劑浸出油和冷榨油的抑菌活性增高,但在過酸(pH3)和過堿(pH11)條件下,培養(yǎng)液本身就能抑制枯草芽孢桿菌和膠紅酵母的生長,而在中性條件和偏酸性條件下,藤椒油抑菌活性基本不變。

表6 介質(zhì)pH對(duì)藤椒油對(duì)枯草芽孢桿菌抑菌活性的影響Table 6 Effect of pH on antibacterial activity of Zanthoxylum armatum DC Prodr. Oil against Bacillus subtilis

注:表中數(shù)據(jù)表示MIC值,表6～表11同。“-”表示培養(yǎng)液的pH3和pH11時(shí),未加樣品溶液,培養(yǎng)液本身就能抑制枯草芽孢桿菌和膠紅酵母的生長，表7同。

表7 介質(zhì)pH對(duì)藤椒油對(duì)膠紅酵母抑菌活性的影響Table 7 Effect of pH on antibacterial activity of Zanthoxylum armatum DC Prodr. Oil against Rhodotorula mucilaginosa

2.3.2 熱處理對(duì)藤椒油抑菌活性的影響 由表8、表9可知,兩種藤椒油經(jīng)不同溫度處理后,仍具有良好的抑菌活性,MIC值均等于不經(jīng)熱處理的MIC值,尤其在121℃濕熱處理30min后,兩種藤椒油抑菌活性基本保持不變,表明藤椒油中的抑菌活性成分具有較高的熱穩(wěn)定性。

表8 熱處理對(duì)藤椒油對(duì)枯草芽孢桿菌抑菌活性的影響Table 8 Effect of thermal treatment on antibacterial activity ofZanthoxylum armatum DC Prodr. Oil against Bacillus subtilis

表9 熱處理對(duì)藤椒油對(duì)膠紅酵母抑菌活性的影響Table 9 Effect of thermal treatment on antibacterial activity of Zanthoxylum armatum DC Prodr. Oil against Rhodotorula mucilaginosa

2.3.3 紫外照射對(duì)藤椒油抑菌活性的影響 表10、表11表明,隨紫外處理時(shí)間的變化,兩種藤椒油的抑菌活性保持不變。說明藤椒油中的抑菌活性成分對(duì)紫外線具有極高的穩(wěn)定性。

表10 紫外照射對(duì)藤椒油對(duì)枯草芽孢桿菌抑菌活性的影響Table 10 Effect of ultraviolet on antibacterial activity ofZanthoxylum armatum DC Prodr. Oil against Bacillus subtilis

表11 紫外照射對(duì)藤椒油對(duì)膠紅酵母抑菌活性的影響Table 11 Effect of ultraviolet on antibacterial activity of Zanthoxylum armatum DC Prodr. Oil against Rhodotorula mucilaginosa

3 結(jié)論

兩種藤椒油對(duì)不同菌種都具有抑制作用,但溶劑浸出油對(duì)細(xì)菌、酵母菌和霉菌的抑菌活性強(qiáng)于冷榨油,其中溶劑浸出油對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制效果最好,MIC為0.78125mg/mL;冷榨油對(duì)枯草芽孢桿菌和膠紅酵母抑制效果最好,MIC為6.25mg/mL。溶劑浸出油對(duì)枯草芽孢桿菌和膠紅酵母殺菌效果最好,MBC為3.125mg/mL;冷榨油除對(duì)金黃色葡萄球菌的殺菌效果最弱,MBC達(dá)到25mg/mL外,對(duì)其他五種菌殺菌的作用效果相差不大,MBC為12.5mg/mL。

溶劑浸出油和冷榨油對(duì)黑曲霉和黃曲霉具有不同的抑制效果,且隨質(zhì)量濃度的增大而增強(qiáng),在相同質(zhì)量濃度下,溶劑浸出油在12.5～50mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對(duì)黃曲霉的抑制作用比對(duì)黑曲霉強(qiáng),冷榨油在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)對(duì)黑曲霉的抑制率卻遠(yuǎn)高于對(duì)黃曲霉的。溶劑浸出油對(duì)黑曲霉和黃曲霉的IC50分別為0.0829、0.547mg/mL,冷榨油對(duì)黑曲霉和黃曲霉的IC50分別為1.0348、1.4437mg/mL。

熱處理和紫外照射對(duì)兩種藤椒油的抑菌活性影響不明顯;介質(zhì)pH對(duì)藤椒油抑菌活性具有一定的影響,堿性條件下溶劑浸出油和冷榨油的抑菌活性增高,而在中性條件和偏酸性條件下,藤椒油抑菌活性基本不變。

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Study on antibacterial activity and stability ofZanthoxylumarmatumDC Prodr. oil

ZHOU Ting,PU Biao*,JIANG Huan-xiao,LIU Chun-yan

(College of Food Science,Sichuan Agricultural University,Ya’an 625014,China)

The antibacterial activity ofZanthoxylumarmatumDC Prodr. oil against common bacteria and yeasts were tested by using inhibition zone experiment and tube double dilution method to determine minimum inhibitory concentration(MIC)and minimum bactericidal concentration(MBC). The antibacterial effect of oil against mould were tested by using growth rate method. The oil was also studied for its stability to thermal treatment,ultraviolet and pH. The results showed thatZanthoxylumarmatumDC Prodr. oil had certain effect on restraining the growth of all the bacteria in the test. While the antibacterial effect of oil extracted from absolute ether were stronger than cold presssed oil.

ZanthoxylumarmatumDC Prodr. oil;antibacterial activity;stability

2014-09-03

周婷 (1989-)，女，碩士研究生，研究方向：果蔬加工理論與技術(shù)。

*通訊作者:蒲彪(1956-)，男，博士，教授，研究方向:果蔬加工、功能性食品。

TS201.3

A

1002-0306(2015)11-0106-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.11.013