豉香型白酒酒餅中高產乙酸乙酯酵母菌的分離鑒定及發酵性能研究

黃光建,徐學鋒,+,郭梅君,曹 勁,楊幼慧,*

(1.華南農業大學食品學院,廣東廣州 510642;2.廣東省九江酒廠有限公司,廣東佛山 528203)

豉香型白酒酒餅中高產乙酸乙酯酵母菌的分離鑒定及發酵性能研究

黃光建1,徐學鋒1,+,郭梅君2,曹 勁1,楊幼慧1,*

(1.華南農業大學食品學院,廣東廣州 510642;2.廣東省九江酒廠有限公司,廣東佛山 528203)

從豉香型白酒酒餅中分離獲得高產乙酸乙酯酵母菌J10,其乙酸乙酯產量為3.119g/L。根據對該乙酸乙酯產生菌的形態學特征和5.8S rDNA-ITS序列分析,鑒定該菌為異常畢赤酵母。通過采用單因素和正交實驗對該菌發酵條件進行優化,獲得該菌的最佳發酵條件:小麥糖化液起始糖度10°Bx,pH4.0,發酵溫度28℃,發酵時間3d。在此優化條件下,乙酸乙酯產量達8.05g/L,比優化前提高158.04%。

豉香型白酒,乙酸乙酯,異常畢赤酵母,發酵條件優化

乙酸乙酯作為白酒的重要香味物質,主要由微生物特別是產酯酵母代謝產生,它能使酒體更加香醇,其含量對白酒的品質有重要影響。豉香型白酒是主產于我國珠三角地區的小曲酒,酒體玉潔冰清,豉香獨特,醇和甘滑,余味爽凈,在嶺南地區及華僑界享有盛譽[1]。由于生產工藝獨特,豉香型白酒中以乙酸乙酯為主的酯類含量較低,風味上與其他白酒有較大差異[2]。利用產酯酵母提高乙酸乙酯等風味物質的產量,對于提升豉香型白酒的感官品質有重要意義[3]。

近年來,有關產酯酵母的研究主要集中在從酒曲中分離產酯酵母,并將其應用于濃、清、特、老白干等香型的白酒生產中,對提高不同香型白酒的總酯、四大乙酯和丙酸乙酯含量、使酒體醇厚、諸香協調等方面起到了較好效果[4-9],在小曲酒中的應用也剛剛起步,董士偉等篩選出產酯酵母用于豉香型白酒提香,產乙酸乙酯達1.39g/L,取得一定效果[3];胡家俊等從小曲中分離得到多株產乙酸乙酯酵母,最高產酯量為0.465g/L[10]。為了進一步提高豉香型酒中乙酸乙酯含量,本研究從豉香型白酒酒餅中分離產酯酵母,并應用5.8S rDNA-ITS分析方法進行快速鑒定,通過優化發酵條件,提升產酯酵母的產酯能力,為后續工藝改進提供優良的菌種資源,以達到提高豉香型白酒品質、生產優質豉香型白酒的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酒餅 廣東省九江酒廠有限公司提供,以自然接種酒丸制成。

分離培養基 葡萄糖20g,酵母膏10g,蛋白胨20g,瓊脂20g,蒸餾水定容到1000mL,115℃,滅菌20min;發酵培養基 取適量小麥經研磨后裝入1L三角瓶中,加入適量自來水,煮沸30min使之充分糊化,將糊化液置于60℃恒溫水浴鍋中,加入1g糖化酶保溫糖化2h,然后離心過濾,得上清糖化醪,保證糖化醪培養基的糖度高于12°Bx,冷藏待用。

生化培養箱 LRH-250A型,廣東省醫療器械廠;手持折光儀 WYT型,成都光學廠;pH計 pHS-25型,上海偉業儀器廠;氣相色譜儀 GC17A型,島津分析儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 分離初篩 采用稀釋涂布法將酒餅菌懸液進行稀釋涂布:稱1g酒餅加入100mL無菌水中混合均勻,以10倍稀釋法稀釋至10-7,取稀釋菌液0.1mL分別涂布于分離培養基平板上,于30℃培養48h;根據菌落形態及鏡檢結果,確定初篩菌株,經劃線分純后分別斜面保存備用。

1.2.2 復篩 聞香：對初篩純化的菌株進行小麥糖化液固體培養并嗅聞評定,記錄各菌株酯香味(香蕉、蘋果等香味)的強弱;產物檢測 將初篩菌株于發酵培養基中進行液體培養,檢測乙酸乙酯和總酯生成量。

1.2.3 基于5.8S rDNA-ITS序列的分子鑒定

1.2.3.1 基因組DNA提取 具體方法參照文獻[11]。

1.2.3.2 5.8S rDNA-ITS測序 以基因組DNA為模板,使用酵母菌5.8S rDNA-ITS通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)進行PCR,產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后,回收純化產物,由上海美吉生物醫藥科技有限公司完成測序。

1.2.3.3 系統發育分析 將測序獲得的酵母J10的5.8S rDNA-ITS序列與GenBank核酸數據庫進行BLAST比對分析,用Clustal W和MEGA Neighbor-Joining法構建系統發育樹,對進化樹進行親緣關系和系統發育評估分析。

1.2.4 發酵性能研究

1.2.4.1 裝液量對J10總酯產量的影響 250mL三角瓶分別裝50、100、150、200mL 12°Bx小麥糖化液,接入2%活化種子液,搖勻,30℃靜置培養5d,進行總酯檢測分析。

1.2.4.2 轉速對J10總酯產量的影響 裝有100mL 12°Bx小麥糖化液的250mL三角瓶中接入2%活化種子液,搖勻,用八層紗布封口,分別以轉速0(靜置)、50、100、150r/min30℃培養5d,進行總酯檢測分析。

1.2.4.3 初始糖度對總酯產量的影響 分別取糖度為6、8、10、12、14°Bx、pH6.0的小麥糖化液100mL接種2%活化種子液,于30℃靜置培養5d,進行總酯檢測分析。

1.2.4.4 pH對總酯產量的影響 分別取pH為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0的12°Bx小麥糖化液100mL接種2%活化種子液,于30℃靜置培養5d,進行總酯檢測分析。

1.2.4.5 發酵時間對總酯產量的影響 在100mL 12°Bx,pH6.0的小麥糖化液中接入2%種子液,于30℃靜置培養不同的時間(2、3、4、5、6、7d),進行總酯檢測分析。

1.2.4.6 發酵溫度對總酯產量的影響 在100mL 12°Bx,pH6.0的小麥糖化液中接入2%種子液,于不同溫度(22、25、28、30、32℃)靜置培養5d,進行總酯檢測分析。

1.2.4.7 底物對總酯產量的影響 在100mL 12°Bx,pH6.0的小麥糖化液中接入2%種子液,分別添加2%乙醇,0.2%乙酸和0.1%磷酸二氫鉀,于30℃靜置培養5d,進行總酯檢測分析。

1.2.4.8 接種量對產酯的影響 分別在100mL 12°Bx,pH6.0,酒精度為2%vol的小麥糖化液中按1%、2%、3%、4%、5%、6%(v:v)的比例接入活化種子液,于30℃靜置培養5d,樣品進行檢測分析。

1.2.4.9 產酯發酵條件優化 根據上述單因素實驗結果,選擇影響菌體生長和總酯產量較為顯著的培養基初始糖度、pH、發酵溫度和時間為考察因素,按L9(34)進行正交實驗(見表1),以總酯產量為檢測指標,確定最優發酵條件。

表1 正交實驗設計因素水平表Table 1 Factors and levels in the orthogonal experiments

1.2.5 乙酸乙酯和總酯的測定 參照國標GB/T10345-2007指示劑法[12]。

1.3 數字統計分析

本研究使用SPSS16.0軟件對正交設計實驗結果進行分析。

2 結果與分析

2.1 酵母的篩選

經過分離培養基篩選分離得到15株疑似酵母菌,分屬五種不同的形態,各選1個代表菌株進行形態和理化指標檢測,結果見表2。

表2表明,在供試的5株酵母菌中,菌株J10產酯最高,總酯達3.298g/L,乙酸乙酯含量為3.119g/L,占總酯量的94.57%,顯著高于其它菌株;進一步觀察其菌落和細胞形態:菌落直徑1～1.5mm,有水果香;液態培養表面有菌膜,皺紋較細、薄,形成沉淀,液體澄清;鏡檢細胞形態為圓形至橢圓形,芽殖,無菌絲。

2.2 5.8S rDNA-ITS分析

2.2.1 PCR擴增及測序 樣品DNA成功地擴增出約600bp的片段(見圖1),與酵母預期5.8S rDNA-ITS目的片段長度相符,且無非特異性條帶,空白對照為陰性。將目標條帶進行切膠回收,送公司測序。

表2 酵母的菌落形態及理化指標Table 2 The colonial morphology and physicochemical property of yeast

注：*“-”表示乙酸乙酯含量較低,沒有進行氣相檢測。

圖1 菌株J10 5.8S rDNA-ITS PCR擴增結果Fig.1 PCR amplification of 5.8S rDNA-ITS of J10注：M:Marker DL2000,泳道1:J10,泳道2:陰性對照。

2.2.2 測序結果 通過測序得知擴增的DNA片段分子大小為618bp,且測序結果如下:

2.2.3 系統發育分析及鑒定 將菌株J10的5.8S rDNA-ITS序列與GenBank核酸數據庫中的序列進行BLAST比對,結果顯示該序列與10個菌株的同源序列的同源性均高達99%以上,具有高度的相似性。以釀酒酵母Saccharomycescerevisiae的同源序列為外群,將供試菌株J10和10個最相似菌株的5.8S rDNA-ITS序列構建系統發育進化樹,如圖2所示。10個菌株與J10聚為一類,因Wickerhamomycesanomalus和Pichiaanomala為同物異名[13],結合菌落形態及顯微觀察結果,確定J10屬于Wickerhamomycesanomalus。

圖2 基于5.8SrDNA-ITS序列的NJ系統樹Fig.2 Phylogenetic tree constructed with 5.8S rDNA-ITS using the neighbor-joining method

2.3 J10產酯發酵性能研究

2.3.1 不同裝液量和轉速對J10總酯產量的影響 發酵過程中裝液量和轉速對Jl0產酯的影響分別見圖3、圖4。由圖3可知,裝液量對J10產酯效果影響顯著,隨著裝液量的增加,產酯量逐漸增大,裝液量為100mL(裝液系數為0.4)時產酯量達到最大,而隨后又隨著裝液量的增加而遞減,表明裝液量為100mL(裝液系數為0.4)時最利于J10的產酯培養;圖4表明:裝液量為100mL時Jl0靜置培養的產酯能力明顯高于搖床培養,產酯量達到3.34g/L,隨著轉速的增加,產酯明顯呈下降趨勢。可能原因如隋延鐸[14]在研究產酯酵母產酯條件時指出,產酯酵母在繁殖及產酯時均需要一定量的氧氣,但供氧量過大會阻止產酯作用的進行。

圖3 不同裝液量對J10總酯產量的影響(n=3)Fig.3 Effects of liquid medium volume on the yield of total ester(n=3)

圖4 不同轉速對J10總酯產量的影響(n=3)Fig.4 Effect of rotation speeds on the yield of total ester(n=3)

2.3.2 初始糖度對總酯產量的影響 由圖5可知,隨著初始糖度的增加,發酵液總酯產量不斷上升,當糖度為12.0°Bx時產量達到3.14g/L,表明菌株J10發酵產酯的最佳初始糖度為12.0°Bx。

圖5 初始糖度對總酯產量的影響(n=3)Fig.5 Effect of initial concentration of sugar on the yield of total ester(n=3)

2.3.3 pH對總酯產量的影響 不同pH對總酯產量的影響見圖6。發酵液pH主要影響發酵過程中各種酶的活性。圖6表明,培養基初始pH在3.0時,總酯產量達到最大值,為4.23g/L,但隨著pH增大總酯生成量減少,本研究表明產酯酵母在較低pH下,能夠產生大量的酯類,這與關陽等對產酯酵母特性的研究結果基本是一致的[15]。

圖6 pH對總酯產量的影響(n=3)Fig.6 Effect of pH on the yield of total ester(n=3)

2.3.4 發酵時間對總酯產量的影響 發酵時間對總酯產量的影響見圖7。由圖7可知,發酵3d時總酯產量最高,為4.58g/L。但隨著發酵時間延長,總酯產量逐漸減少,與廖永紅等[16]在對3種產酯酵母總酯的生成特性研究時發現的結論一致,其可能原因是隨發酵時間延長,在發酵中難揮發性酯類也逐漸轉變為易揮發性酯類或其他物質所致,因此J10合成總酯的適宜發酵時間為3d。

圖7 發酵時間對總酯產量的影響(n=3)Fig.7 Effect of fermentation time on the yield of total ester(n=3)

2.3.5 發酵溫度對總酯產量的影響 不同溫度對總酯產量的影響見圖8。圖8表明,發酵溫度在25℃時總酯產量最大,達5.13g/L,表明在較低溫度下發酵有利于產酯酵母的產酯。

圖8 發酵溫度對總酯產量的影響(n=3)Fig.8 Effect of fermentation temperature on the yield of total ester(n=3)

2.3.6 不同底物對總酯產量的影響 由圖9可知,分別添加乙醇、乙酸和磷酸二氫鉀均可提高總酯產量,但發酵液里共同添加乙醇、乙酸和磷酸二氫鉀最有利于總酯的形成,其總酯產量達5.03g/L。在培養基中添加乙醇、乙酸和磷酸二氫鉀等底物明顯利于產酯酵母發酵產酯,分析原因可能與產酯酵母酯酶代謝合成酯類的機制密切相關。產酯酵母能耐受一定濃度的酒精,能以乙醇作為碳源正常生長代謝,且有較強的氧化特性,從而促進了產酯酵母的呼吸作用[17];乙酸是形成乙酸乙酯的重要底物,而磷酸根離子是微生物生長繁殖和代謝的必需成分,適宜的磷含量有利于產酯酵母代謝形成酯類。因此,可以通過在發酵液中適當添加乙醇、乙酸和磷酸二氫鉀等成分,提高產酯酵母產酯能力,促進白酒提香和增強后味。

圖9 不同底物對總酯產量的影響(n=3)Fig.9 Effect of the substrate on the yield of total ester(n=3)注：1:CK;2:乙醇;3:乙酸;4:乙醇+乙酸; 5:磷酸二氫鉀;6:乙醇+乙酸+磷酸二氫鉀。

2.3.7 接種量對總酯產量的影響 接種量對總酯產量的影響見圖10。適宜的接種量有利于菌體合理利用有限的營養物質進行大量繁殖。由圖10可知,總酯的產量隨著接種量的增大而升高,但當接種量大于4%時,總酯產量降低。因此,菌株J10合成總酯的適宜接種量是4%。

表3 發酵條件正交實驗結果Table 3 The results in the orthogonal

表4 正交設計方差分析表Table 4 Analysis of variance of orthogonal test

#,注:**表示該指標影響極顯著。

圖10 接種量對總酯產量的影響(n=3)Fig.10 Effect of inoculating rate on the yield of total ester(n=3)

2.3.8 產酯發酵條件優化 根據單因素對產酯影響的極差值,選擇對產酯影響較為顯著的四個因素,即培養基的初始糖度、pH、發酵溫度和時間,采用L9(34)正交實驗考察其對J10菌株合成總酯的影響,結果見表3和表4。

由表3極差分析和表4方差分析可知,在發酵過程中,對J10菌株總酯產量影響的因素大小為B pH>D時間>A糖度>C溫度,四個因素對總酯的產量影響均達極顯著(p<0.01)。同時從表3可以得出J10生成總酯的最優組合為A1B3C3D2,即培養基的初始糖度為10°Bx,pH為4.0,發酵溫度為28℃,發酵時間為3d,接種量為4%,添加2%乙醇,0.2%乙酸和0.1%磷酸二氫鉀作為發酵底物。

經驗證,在該條件下,總酯的生成量可達8.51g/L,乙酸乙酯的產量為8.05g/L,比優化前提高了158.04%。

3 結論

目前應用于白酒中的產酯酵母多屬于漢遜酵母屬、產朊酵母屬、假絲酵母屬和球擬酵母屬等[18-19],本研究分離鑒定的產酯酵母J10為異常畢赤酵母,通過對Jl0的發酵條件進行優化,其總酯產量可達8.51g/L,乙酸乙酯8.05g/L,比優化前提高了158.04%,與已報道的同類菌相比[9,20-21],有較強的產乙酸乙酯能力,是白酒生香的重要菌種,具有較好的應用前景。有研究表明[22-23],異常畢赤酵母能耐受低pH、低水分活度、高滲透壓、厭氧等極端環境,相比有氧,限氧條件不僅能夠誘導異常畢赤酵母進行酒精發酵,激活發酵途徑中的關鍵酶,而且對葡萄糖的吸收率和乙醇、甘油、乙酸乙酯等代謝物含量都有所增加。本研究為豉香型白酒的品質提升提供了優良的菌種資源,有關其在豉香型白酒中的應用還需進一步研究。

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食鹽生產限額年度計劃審批取消 鹽業去行政化

國務院再取消49項非行政許可審批事項，今后不再保留“非行政許可審批”這一審批類別。至此，國務院部門非行政許可審批事項清理工作全面完成，“非行政許可審批”這一概念退出了歷史舞臺，其中就包括食鹽生產限額年度計劃審批、食鹽分配調撥計劃和干線運輸計劃審批。業內認為，食鹽生產配額取消后，企業將根據市場供求關系生產產品，逐漸發揮市場配置資源的作用，為將來的鹽業市場化改革打下基礎。

我國鹽業市場行政色彩一直比較濃重，目前省、市、縣三級鹽務管理局，不僅具有區域內鹽業監管、計劃調配職能，還掌握著食鹽的經銷業務。而經銷業務則由管理局的另一塊牌子“鹽業公司”來負責。鹽務管理局與鹽業公司“兩塊牌子，同一套班子”，在食鹽專營體制下，既是“裁判”又是“運動員”。

除了相關體制改革外，食鹽價格改革也是市場關注的焦點。國家發改委發布《中央定價目錄》(征求意見稿)，向社會公開征求意見，與2001年版中央定價目錄相比，新的目錄中定價種類約減少46%，具體項目約減少80%，但備受關注的食鹽價格仍然沒有放開。

來源：中國食品科技網

Isolation and identification of a high-yield ethyl acetate yeast from xiaoqu of Soybean-flavor liquor and its fermentation characterization

HUANG Guang-jian1,XU Xue-feng1,+,GUO Mei-jun2,CAO Jin1,YANG You-hui1,*

(1.College of Food Science,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China;2.Guangdong Jiujiang Distillery Company Limited,Foshan 528203,China)

A high-yield ethyl acetate yeast J10 was isolated from the xiaoqu of soy-flavor liquor by screening and ethyl acetate analysis. The highest ethyl acetate was observed as 3.119g/L. According to the morphological properties and 5.8S rDNA-ITS sequence analysis of J10,the strain was identified asWickerhamomycesanomalus. Furthermore,the single factor and orthogonal experiments were adopted to optimize the fermentation conditions of J10. The initial concentration of wheat hydrolyzed liquid was 10°Bx,pH4.0,and J10 was fermented at 28℃ for 3d. The highest ethyl acetate of 8.05g/L was achieved after the optimization. It’s higher 158.04% than that of the control.

soybean-flavor liquor;ethyl acetate;Wickerhamomycesanomalus;optimization of fermentation process

2014-08-25 +并列第一作者。

黃光建(1987-),男,碩士,研究方向:發酵工程、釀酒。 徐學鋒(1977-),男,博士,副教授,研究方向:應用微生物學。

*通訊作者:楊幼慧(1956-),女,碩士,教授,研究方向:發酵工程、釀酒。

國家科技部農業科技成果轉化資金項目(2012E0002005)。

TS201.3

A

1002-0306(2015)11-0153-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.11.022