P53蛋白參與靈芝酸抑制癌細胞增殖的過程

唐 文,吳 穎,王雨薔,孫培龍,歐陽晶晶

(1.上海應用技術學院 香料香精技術與工程學院 食品系，上海 201418；2.上海應用技術學院 化學與環境工程學院，上海 201418)

P53蛋白參與靈芝酸抑制癌細胞增殖的過程

唐 文1,吳 穎2,王雨薔1,孫培龍1,歐陽晶晶1

(1.上海應用技術學院 香料香精技術與工程學院 食品系，上海 201418；2.上海應用技術學院 化學與環境工程學院，上海 201418)

通過對靈芝三萜類物質(靈芝酸T)抑制肺癌H1299(p53-/-)細胞、肺癌95-D(p53+/+)細胞增殖實驗,考察了P53蛋白對靈芝酸抑制增殖作用的影響。結果表明:通過比較IC50,表達野生型P53蛋白的95-D細胞比不表達P53蛋白的H1299細胞對靈芝酸T的敏感性高3.3倍。P53抑制劑Pifithrin-α與靈芝酸T聯合處理能顯著地降低靈芝酸T對95-D細胞增殖的抑制率(p<0.05)。進一步研究表明靈芝酸T可誘導95-D(p53+/+)中P53蛋白表達,并促進細胞凋亡。以上結果提示P53蛋白參與了靈芝酸T抑制腫瘤細胞增殖的過程,可能是靈芝三萜類物質抗腫瘤的作用靶點。本研究可為開發輔助抑制腫瘤類保健食品研究提供理論基礎。

靈芝酸T,P53蛋白,增殖抑制,保健食品

靈芝(Ganodermalucidum)是一種傳統的藥用真菌,《中華人民共和國藥典》收錄了靈芝作為法定中藥材[1],2001年靈芝被列入《可用于保健食品的真菌菌種名單》。截止到2013年,國內已注冊近600種靈芝類保健食品,其中64%具有免疫調節作用,6%具有護肝作用,4%具有輔助抑制腫瘤作用(基于對中國國家食品藥品監督管理局網中靈芝保健品公開信息的統計分析),保健功能主要集中在免疫調節功能上,需要在靈芝保健功能研究方面加以拓展和深化。同時,隨著生活方式、環境條件及人口老齡化等影響腫瘤發生發展因素的改變,自20世紀70年代以來,我國癌癥呈明顯上升趨勢,現已成為城、鄉居民的首要死因,其中肺癌的上升趨勢尤為明顯[2]。因此,研究靈芝輔助抑制腫瘤保健功能具有一定的理論和實際意義。

三萜類化合物(如靈芝酸類)是靈芝中重要活性物質之一[3-4]。自Toth O等[5]報道靈芝三萜類化合物的抗癌活性以來,多種靈芝酸被證實具有抑制腫瘤增殖和轉移功能[6-7]。本課題組前期研究表明靈芝酸誘導腫瘤細胞凋亡的途徑是依賴于線粒體的內源性凋亡途徑[8],P53蛋白在靈芝酸抑制腫瘤轉移過程中發揮作用[9]。但P53蛋白是否參與靈芝酸抑制腫瘤細胞增殖的過程還未見報道。

本研究擬采用表達p53基因的95-D肺癌細胞和p53基因缺失的H1299肺癌細胞,通過研究靈芝酸T抑制兩種細胞增殖效果的差異,分析P53蛋白在靈芝酸抗癌細胞增殖過程中的作用,研究結果將為開發功能因子明確的具有輔助抑制腫瘤作用的保健食品提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

細胞株:H1299(人非小細胞肺癌細胞,p53-/-)和95-D(人高轉移肺癌細胞,p53+/+) 購于中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心;靈芝酸T(純度>99%)從赤芝(Ganoderma lucidum)子實體中經制備色譜分離提取,經核磁譜圖與標準品比對鑒定,以DMSO(二甲亞砜)溶解備用。噻唑藍(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide,MTT)、Pifithrin-α-hydrobromide(Pifithrin-α)、RPMI 1640培養基、小牛血清、凋亡分析試劑盒 購于華美生物技術有限公司;鼠抗人p53單克隆抗體(即用型)、DAB顯色試劑盒 購于北京中杉金橋生物技術有限公司。

酶標儀Bio-Rad,USA;CO2培養箱Heraeus,USA;流式細胞儀BD Bioscience,USA。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養方法 H1299和95-D細胞采用常規RPMI1640培養基,青霉素和鏈霉素雙抗,10%小牛血清,37℃,5% CO2條件下培養和繼代。

1.2.2 抑制細胞增殖能力的測定 分別取對數生長期細胞1×105個/mL接種于96孔培養板,每孔0.2mL,6h貼壁后分別加入不同終濃度(8.5,10,25,50μg/mL等)的靈芝酸T溶液處理,對照組加等量體積的溶劑。置37℃,5% CO2及飽和濕度的培養箱培養24h,實驗終止前4h每孔加入5μg/mL MTT 10μL,培養結束后每孔加入0.04mol/L DMSO 200μL,振蕩保溫15min,待MTT還原產物完全溶解,酶標儀以570nm為分析波長,測定吸光度。通過計算得到抑制率:抑制率(%)=(處理組吸光度的平均值/對照組吸光度的平均值)×100。獨立進行3次實驗。每次實驗重復6次,取平均值[8]。

1.2.3 凋亡分析 對數生長期95-D細胞培養4h后,經各種濃度的藥物作用特定的時間后,經胰蛋白酶消化,離心收集細胞(1500r/min × 10min),PBS 洗滌兩遍,以PBS調整細胞濃度為106個/mL,加入RNase,終濃度為100U/mL,37℃保溫30min,加入Annexin V和PI,終濃度為50μg/mL,在常溫下暗反應30min,然后200目濾膜過濾,經流式細胞儀分析凋亡,每次記錄1000～1500個細胞。

1.2.4 P53蛋白的western blotting分析 Western blotting分析P53蛋白,方法完全按照參考文獻[8]的流程操作。

1.2.5 統計學方法 采用SPSS統計軟件對各組數據進行顯著差異性分析,在*p<0.05水平和**p<0.01水平下判斷其顯著差異性。

2 結果與分析

2.1 靈芝酸T抑制95-D和H1299細胞增殖效果的差異

通過比較靈芝酸T抑制H1299(人肺癌細胞,p53-/-)、95-D(人肺癌細胞,p53+/+)細胞增殖效果,考察P53 蛋白是否對抑制過程有影響。圖1表明靈芝酸T對95-D和H1299肺癌細胞增殖均具有抑制能力,表現出一定的濃度依賴性。表達P53 蛋白95-D細胞的生長被明顯地抑制,與之相比,不表達P53 蛋白的H1299細胞對靈芝酸T敏感性較低。靈芝酸T對95-D肺癌細胞的IC50為24.5μg/mL,對H1299肺癌細胞的IC50的理論計算值是80μg/mL,約是95-D的3.3倍。50μg/mL的靈芝酸T處理可抑制78%的95-D細胞增殖,而對H1299細胞的抑制率只有31%。以上結果表明:靈芝酸T劑量依賴性地抑制95-D和H1299細胞增殖,且對95-D細胞更敏感。95-D細胞是表達P53蛋白的腫瘤細胞,因此,可以推測P53蛋白可能參與了靈芝酸T抑制細胞增殖的過程。

圖1 靈芝酸T對H1299和95-D細胞的細胞毒性Fig.1 The cytotoxicity of ganoderic acid T on H1299和95-D cells

圖2表明靈芝酸T處理時間對95-D和H1299細胞增殖過程的影響,根據圖1結果計算出兩種細胞的半數致死濃度為24.5、80μg/mL,做為靈芝酸T處理濃度。結果表明在高濃度(80μg/mL)條件下,靈芝酸T對95-D和H1299細胞增殖的影響在25h之前有極其顯著地差異(p<0.01),對95-D細胞的抑制率顯著地高于對H1299細胞的抑制率。相同濃度(80μg/mL)下,靈芝酸T對95-D細胞在實驗5h即表現出很強的抑制率,達到76%;而H1299細胞在后期才表現出相同的抑制率。在較低濃度(25μg/mL)條件下,靈芝酸T對95-D和H1299細胞增殖的影響在實驗前期(19h之前)差異不顯著,而在實驗后期(19h以后)表現出顯著差異(p<0.05),95-D細胞增殖抑制率顯著高于H1299細胞增殖抑制率。

圖2 靈芝酸T處理時間對H1299 和95-D細胞增殖的影響Fig.2 The time course of the cytotoxicity of ganoderic acid T on H1299和95-D cells

以上結果表明:不表達P53 蛋白的H1299細胞對靈芝酸T處理的抑制反應要比表達的95-D細胞延遲和降低,提示P53 蛋白參與了靈芝酸T抑制腫瘤細胞增殖的過程。

2.2 P53抑制劑Pifithrin-α抑制了靈芝酸T對95-D細胞的細胞毒性

為了確證P53蛋白參與了靈芝酸T抑制腫瘤細胞增殖的過程,選擇P53抑制劑進行比較研究。Pifithrin-α是一種常用的P53抑制劑,能可逆地抑制P53依賴的基因轉錄激活[10]。圖3表明,Pifithrin-α對95-D細胞具有一定的細胞毒性,但在低于5μmol/L濃度下對95-D細胞的毒性很小(抑制率低于2.5%),因此選擇5μmol/L作為下一步實驗的處理濃度。

圖3 Pifithrin-α對95-D細胞的細胞毒性Fig.3 The cytotoxicity of Pifithrin-α on 95-D cells

添加5μmol/L P53抑制劑Pifithrin-α后,不同濃度靈芝酸T抑制95-D細胞增殖的效果顯著下降,10,25μg/mL處理組和對照組間抑制率有顯著性差異(p<0.01)。而H1299細胞因為不表達P53蛋白,Pifithrin-α對靈芝酸T抑制其增殖沒有影響(數據未列出)。圖4結果表明:P53蛋白參與介導了靈芝酸T抑制肺癌細胞95-D增殖的過程。但50μg/mL處理組差異不顯著,提示在較高濃度下,靈芝酸T可能還有其他的不依賴于P53調節的抑制癌細胞增殖的途徑[8],因此對p53基因野生型和缺陷型細胞都具有較大的毒性。

圖4 Pifithrin-α和靈酸T聯合用 對95-D細胞增殖的影響Fig.4 The cytotoxicity of Pifithrin-α and Ganoderic acid T on 95-D cells

2.3 靈芝酸T處理增加了細胞內P53蛋白的表達量并誘導95-D細胞凋亡并

靈芝酸T(50μg/mL)分別處理95-D細胞0,4,8h后收集細胞,進行P53蛋白的western blotting分析,結果如圖5所示。結果表明靈芝酸T可誘導95-D細胞內P53蛋白表達量增加,具有時間依賴性。以上結果表明:在靈芝酸T抑制細胞增殖過程中,P53蛋白參與了這個過程。

圖5 靈芝酸T誘導95-D細胞P53蛋白的表達Fig.5 Ganoderic acid T induced the accumulation of P53 protein in 95-D cells

靈芝酸T(50μg/mL)分別處理95-D細胞0,4,8h后進行流式細胞術分析。結果表明靈芝酸T可誘導95-D細胞的凋亡,且隨著處理時間增加凋亡率逐漸增加。靈芝酸T(50μg/mL)處理8h后,總凋亡率(早期凋亡和晚期凋亡)可達到69%。P53蛋白是細胞生長的負調控因子,可通過誘導凋亡抑制癌細胞增殖,圖5、圖6數據顯示隨著P53蛋白表達量的增加,癌細胞總凋亡率增加。

圖6 靈芝酸T誘導95-D細胞凋亡Fig.6 Ganoderic acid T induced the apoptosis of 95-D cells注:A：0h；B：4h；C：8h。

P53蛋白是一種53ku的核內磷酸化蛋白,是細胞生長的負調控因子。以上數據表明較低濃度靈芝酸T可以刺激95-D腫瘤細胞內野生型P53蛋白表達,進而誘導凋亡并抑制細胞增殖。同時較高濃度靈芝酸T有直接的細胞毒性,對不表達P53蛋白的癌細胞也具有抑制增殖能力。雖然進一步的調控機制有待深入研究,但現有數據已證明靈芝酸T通過誘導P53蛋白表達和凋亡進而抑制腫瘤細胞增殖。結合我們前期的靈芝酸增敏增效作用研究[2],提示靈芝酸具有輔助抑制腫瘤作用。

3 結論與討論

靈芝酸T對H1299肺癌細胞的細胞毒性要明顯地低于對95-D肺癌細胞的細胞毒性,這兩種細胞的主要差異體現在P53蛋白表達上,H1299肺癌細胞為p53基因缺失型,不表達P53蛋白[11]。95-D肺癌細胞可表達野生型P53蛋白[7]。添加p53抑制劑后,靈芝酸T抑制95-D細胞增殖的能力顯著下降。Western blotting 分析表明,靈芝酸T處理提高了95-D細胞內P53蛋白的表達量并誘導癌細胞凋亡。以上結論表明:靈芝酸處理95-D細胞會刺激P53蛋白的表達,P53蛋白介導了靈芝酸T抑制腫瘤細胞增殖和誘導凋亡的過程。P53蛋白或p53基因可能是靈芝酸發揮抗癌作用的靶點之一。以上結論對于靈芝保健食品研究具有一定的意義。

我國是保健食品生產和消費大國,但保健食品行業創新水平參差不齊,技術創新率總體偏低。第三代保健食品的研發尚處于起步階段。在已注冊的近600種靈芝類保健食品中,主成分為粗多糖的產品占39%,主成分為三萜粗提物的產品占31%,主成分為粗多糖和三萜粗提物混合物的產品占12%,未標注主成分的產品占18%。特別是所有產品均未標注具體的組成成分及各成分比例,導致功效成分不準確,產品質量控制標準不清晰、作用機制不明確等問題的出現。因此,迫切需要確切功效和特定成分之間的對應關系研究。

我國中藥材品種豐富,且有長期的臨床使用實踐,是保健食品研制的有效物質和重要理論來源。因此,充分利用這些優勢,結合現代藥理學研究技術,提升保健食品的品質和功能,對發展有中國特色的保健食品具有重要的意義。

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和醫科大學聯合出版社,1996.

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Inhibition of ganoderic acid mediated by P53 protein on cancer cells proliferation

TANG Wen1,WU Ying2,WANG Yu-qiang1,SUN Pei-long1,OUYANG Jing-jing1

(1.Department of Food Science and Technology,School of Perfume and Aroma Technology,Shanghai Institute of Technology,Shanghai 201418,Chin;2.School of Chemical and Environmental Engineering,Shanghai Institute of Technology,Shanghai 201418,China)

The roles of P53 protein in the inhibitory effect of ganoderic acid T(GA-T)on human lung cancer cells proliferation were evaluated by H1299(p53-/-)and 95-D(p53+/+)cells. The results showed that 95-D cell which expressed P53 protein was more sensitive to the GA-T than H1299 cell which unexpressed P53 protein. The cytotoxicity of GA-T on 95-D cells was 3.3 times higher than that of H1299 cell significantly. The cytotoxicity of GA-T on 95-D cancer cells decreased significantly after pifithrin-α treatment(p<0.05). Furthermore,GA-T stimulated the expression of P53 in 95-D cancer cells and induced the apoptosis of 95-D cancer cells dose-dependently. The results mentioned above proved that P53 participated in the process of anti-proliferation of cancer cell by GA-T and should be a potent target of ganoderic acids. The results in this paper should provide the theoretical foundation for development of functional food.

ganoderic acid T;P53 protein;anti-proliferation;function food

2014-05-04

唐文(1970-),男，博士,副教授,研究方向:食品生物技術、生化藥理學。

TS201.3

A

1002-0306(2015)11-0193-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.11.030