泰山蛹蟲草多糖對免疫抑制小鼠血清蛋白含量和體內抗氧化能力的影響

張圣方,趙龍玉,王 雪,趙鳳春,楊正友

(山東農業大學生命科學學院微生物系,農業微生物重點實驗室,山東泰安 271018)

泰山蛹蟲草多糖對免疫抑制小鼠血清蛋白含量和體內抗氧化能力的影響

張圣方,趙龍玉,王 雪,趙鳳春,楊正友*

(山東農業大學生命科學學院微生物系,農業微生物重點實驗室,山東泰安 271018)

目的:研究泰山蛹蟲草多糖(Cordycepstaishanensispolysaccharide,CTP)對免疫抑制小鼠血清蛋白含量和抗氧化能力的影響。方法:通過對小鼠灌服多糖實驗,觀察CTP對小鼠血清總蛋白、白蛋白及球蛋白含量和抗氧化能力的影響。結果:與環磷酰胺(Cyclophosphamide,CY)模型組比較,三個CTP組的血清總蛋白、球蛋白和白蛋白含量均極顯著增高(p<0.01);三個CTP組的紅細胞SOD活性和血清CAT活性均顯著提高(p<0.01或p<0.05),紅細胞MDA含量均極顯著減少(p<0.01)。結論:CTP能顯著提高CY所致的免疫損傷小鼠的血清蛋白含量,在一定程度上CTP能減輕CY對小鼠肝臟的損害作用;CTP也能改善CY所致免疫損傷小鼠的抗氧化能力。

泰山蛹蟲草多糖,環磷酰胺,免疫損傷小鼠,血清蛋白,體內抗氧化

泰山蟲草(Cordycepstaishanensis)是一種自然野生的蛹蟲草,隸屬于子囊菌門(Ascomycota)、核菌綱(Pyrenomycetes)、麥角菌目(Clavioipitales)、麥角菌科(Clavicipitaceae)、蟲草屬(Cordyceps)中的子囊真菌[1]。蛹蟲草多糖是從蛹蟲草子實體或菌絲體中提取的具有多種生物學和免疫學活性的真菌多糖。它具有抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、提高免疫力等功能,近年來已引起人們的廣泛關注[2-8]。一些研究也發現多糖能使血清蛋白濃度升高[9]。但是泰山蛹蟲草多糖(CTP)是否在生物體內具有明顯的抗氧化功能,是否能夠提高血清蛋白含量并具有護肝解毒的作用,目前仍無相關文獻報道。

肝臟是蛋白質合成的重要器官之一,是合成血漿白蛋白的器官[10]。血清總蛋白主要來自肝臟的合成和腸道的吸收,主要包括白蛋白和球蛋白。肝臟損傷時,蛋白質合成障礙可導致總蛋白和白蛋白含量減少。研究發現注射環磷酰胺(CY)會致使小鼠總蛋白、球蛋白、白蛋白降低[11],還會對小鼠正常組織細胞造成了損傷,在實驗動物氧化和抗氧化方面有很大的影響[12]。CY是目前應用的免疫抑制劑中作用最強的藥物之一,研究認為CY可廣泛作為免疫抑制模型的造型劑[13-16]。

本研究通過小鼠灌服多糖實驗,檢測小鼠血清蛋白含量,血液SOD、CAT活性和MDA含量的變化,旨在探究CTP對CY所致的免疫抑制小鼠肝臟功能恢復和體內抗氧化能力的影響,為CTP制劑的應用推廣提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

泰山蛹蟲草菌(藥鄉-3)由山東省泰安市農業科學院食用菌研究所提供。

總蛋白(TP)試劑盒、白蛋白(ALB)試劑盒 上海榮盛生物技術有限公司;超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒、過氧化氫酶(CAT)試劑盒 南京建成生物工程研究所;檸檬酸鈉(分析純) 天津市凱通化學試劑有限公司;注射用環磷酰胺(優級純) 江蘇恒瑞醫藥股份有限公司;ICR清潔級昆明小鼠,雄性,體重(20±2)g,由泰山醫學院動物實驗中心提供。

TGL-16B型臺式離心機 上海安亭科學儀器廠;WSZ-160A型漩渦振蕩器 上海一恒科技有限公司;RXZ-300B型人工氣候箱 寧波江南儀器廠;751G型紫外分光光度計 美國Amersham Biosciences公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 制備泰山蛹蟲草多糖制劑 本實驗室采用高效提取和純化蛹蟲草子實體多糖的方法[17-18]獲得的CTP(子實體多糖含量測定為5.10%)。對本實驗室栽培出的泰山蛹蟲草子實體進行水提醇沉提取粗多糖,然后先后經過sevage法脫蛋白、活性炭除色素、透析除小分子雜質和SephadexG-75柱過濾層析,最后得到CTP(苯酚-硫酸法測定多糖質量分數為66.94%)。

1.2.2 動物分組和給藥 60只昆明小鼠隨機平均分為五組:正常對照組(C組)、CY模型組和三個不同劑量的CTP組。飼養期間小鼠自由攝食、飲水。依照表1的給藥方案每天進行定時灌胃,每次每只小鼠灌胃相應濃度的CTP溶液或蒸餾水,連續灌胃19d;第20d,對每只小鼠腹腔注射CY或等體積的生理鹽水。

1.2.3 血樣采集與處理 腹腔注射CY 24h后,所有小鼠摘眼球采血,每10mL血樣加1mL 2.6%的檸檬酸鈉溶液來抗血凝,分裝于Eppendorf管中,-4℃保存,待測。隨后頸椎脫臼處死小鼠。

1.2.4 小鼠免疫器官指數的測定 小鼠頸椎脫臼處死后,摘取脾臟和胸腺,除去表面的結締組織,分析天平稱重。在處死小鼠前要同條件稱量每只小鼠的重量。計算免疫器官指數:胸腺指數=胸腺重量(mg)/小鼠活重(g);脾臟指數=脾臟重量(mg)/小鼠活重(g)。

表1 實驗小鼠分組和給藥方案Table 1 Animal grouping and drug administration of experimental mice

1.2.5 指標的測定 分別按試劑盒說明書測定,血清總蛋白(TP)測定采用雙縮脲法,血清白蛋白(ALB)測定用溴甲酚綠法,血清球蛋白(GLO)含量為血清總蛋白含量與血清白蛋白含量的差值;SOD活性測定采用氮藍四唑比色法,MDA含量測定采用硫代巴比妥酸比色法,CAT活性測定采用鉬酸銨比色法。用紫外分光光度計測得對應OD值。

1.3 數據統計處理

2 結果與討論

2.1 實驗小鼠的胸腺指數和脾臟指數

實驗小鼠的胸腺指數和脾臟指數見表2,對于胸腺指數,與C組相比,CY模型組和低劑量CTP組小鼠胸腺指數極顯著降低(p<0.01),中劑量和高劑量CTP組小鼠胸腺指數與C組差異均不顯著(p>0.05);與CY模型組相比較,中、高劑量CTP組小鼠胸腺指數顯著增加(p<0.05或p<0.01)。

對于脾臟指數,與C組相比較,CY模型組小鼠脾臟指數極顯著降低(p<0.01),高劑量CTP組小鼠脾臟指數顯著提高(p<0.05),低、中劑量CTP組小鼠脾臟指數與C組差異均不顯著(p>0.05);與CY模型組對比,三個不同劑量的CTP組小鼠脾臟指數均極顯著提高(p<0.01)。

Table 2 The effect of thymus and

組別胸腺指數(mg/g)脾臟指數(mg/g)C組4.040±0.059##3.170±0.055##CY模型組3.084±0.355**2.154±0.242**低劑量+CY組3.163±0.064**3.011±0.144##中劑量+CY組3.855±0.089##3.147±0.105##高劑量+CY組3.632±0.389#3.476±0.119*##

注:與C組比較,*p<0.05,**p<0.01;與CY模型組比較,#p<0.05,##p<0.01，表3、表4同。

表3 實驗小鼠血清總蛋白、球蛋白和白蛋白的含量±s,n=12)Table 3 Contents of TP,GLO and ALB in the serum of experimental ±s,n=12)

表4 實驗小鼠血液抗氧化指標測定結果±s,n=12)Table 4 Antioxidant index of the blood in experimental ±s,n=12)

胸腺是T淋巴細胞發育成熟的場所,為中樞免疫器官,其細胞增殖分化受抑制會使機體白細胞總數尤其是淋巴細胞總數降低,使機體免疫功能下降[19]。脾臟是動物體內最大的外周免疫器官,是T、B淋巴細胞定居和對抗原物質產生免疫應答及免疫效應物質(如抗體等)的重要場所。脾臟指數能反映脾臟的發育和功能狀況,間接反映機體的免疫水平[20]。檢測胸腺和脾臟指數的變化可以直觀綜合地反映藥物對機體免疫功能的影響。與C組相比較,CY模型組小鼠脾臟指數和胸腺指數都極顯著降低(p<0.01),在一定程度上可以表征注射劑量為100mg/kg·bw的CY 24h后對小鼠起到了構造免疫抑制模型的作用。

通過表2可知,CTP能夠提高小鼠脾臟和胸腺指數,對CY的抑制有正調節作用。免疫器官指數的增加,說明CTP可在一定程度上促進小鼠機體的細胞免疫,為血清蛋白含量的提高提供了條件。

2.2 實驗小鼠血清蛋白含量的變化

實驗小鼠血清蛋白含量的變化見表3,對于總蛋白含量,與C組比較,CY模型組小鼠血清總蛋白含量極顯著降低(p<0.01),低、中、高劑量的CTP組與C組差異均不顯著(p>0.05),不過中劑量CTP組的總蛋白含量已超過C組;與CY模型組比較,三個不同劑量的CTP組血清總蛋白含量均極顯著增高(p<0.01)。

對于球蛋白含量,與C組比較,CY模型組小鼠血清球蛋白含量極顯著降低(p<0.01),三個不同劑量的CTP組與C組差異均不顯著(p>0.05),其中,低、中、高劑量的CTP組球蛋白含量均已超過了C組;與CY模型組比較,三個不同劑量的CTP血清球蛋白含量均極顯著增高(p<0.01)。

對于白蛋白含量,與C組比較,CY模型組小鼠血清白蛋白含量極顯著降低(p<0.01),三個不同劑量的CTP組與C組差異均不顯著(p>0.05),不過中劑量CTP組的白蛋白含量已高于C組;與CY模型組比較,三個不同劑量的CTP組血清白蛋白含量均極顯著增高(p<0.01)。

通過以上結果可知,中劑量的CTP在促進小鼠血清蛋白含量的增加上效果最為明顯。

肝臟受損傷時,蛋白質發生合成障礙可導致血漿球蛋白和白蛋白含量減少。臨床上以檢測血漿蛋白的含量來協助診斷肝臟疾患,并作為療效觀察,預后判斷的指標[21]。有研究表明給大鼠腹腔注射一定量的CY,其能與大鼠組織細胞中功能基團如DNA,蛋白質分子中氨基、疏基、羥基等作用,發生烷化作用,造成大鼠肝功能抑制,總蛋白、白蛋白、球蛋白降低及外周血白細胞、紅細胞、血小板數減少[22]。李樹鵬等認為,多糖能使血清白蛋白濃度升高可能是由于多糖促進TNF的分泌,TNF能作用于肝臟,使血清白蛋白合成增加[23]。同時,血清蛋白含量的升高與機體免疫功能增強也有很大的關系,血清蛋白主要由白蛋白和球蛋白組成,球蛋白比重很大,由單核巨噬細胞系統產生。本實驗結果表明,與CY模型組比較,三個不同劑量的CTP均能提高免疫抑制小鼠血清中總蛋白、白蛋白、球蛋白的含量,在一定程度上改善CY對肝臟的損傷,促使機體恢復正常。CTP的作用機制可能是多糖調節細胞免疫,血清球蛋白數量增加而引起總蛋白濃度上升;還有可能是因為多糖的護肝解毒的作用。

2.3 實驗小鼠血液抗氧化指標測定結果

實驗小鼠血液抗氧化指標結果見表4,對于SOD活性,與C組比較,CY模型組和低、中、高劑量的CTP組的紅細胞SOD活性均極顯著降低(p<0.01);與CY模型組比較,三個不同劑量的CTP組的紅細胞SOD活性均極顯著提高(p<0.01)。

對于MDA含量,與C組比較,CY模型組小鼠紅細胞MDA含量極顯著增加(p<0.01),低劑量CTP組的MDA含量顯著增加(p<0.05),中、高劑量CTP組的MDA含量與C組差異不顯著(p>0.05);與CY模型組比較,三個不同劑量的CTP組的紅細胞MDA含量均極顯著減少(p<0.01)。

對于CAT活性,與C組比較,CY模型組小鼠血清CAT活性極顯著降低(p<0.01),低、中劑量CTP組血清CAT活性顯著降低(p<0.05);與CY模型組比較,三個不同劑量的CTP組的血清CAT活性均顯著提高(p<0.01或p<0.05),且CAT活性隨著多糖濃度的增大而增高。

生物在長期進化過程中,自身形成了防御過氧化損害系統。正常狀態下,促氧化與抗氧化之間保持著一定的平衡狀態,如果活性氧自由基的產生超過了機體的清除能力,或機體抗氧化系統受損時,體內自由基蓄積,會引起脂質氧化,產生過量脂質過氧化物,損傷核酸、蛋白質等細胞成分。研究表明,許多多糖對物理、化學及生物來源的多種活性氧具有清除作用,提高抗氧化酶活性及機體抗氧化能力。據報道,油菜花粉多糖能拮抗環磷酰胺,降低小鼠血清中MDA含量,使血清SOD活性恢復至正常水平[24]。猴頭菇多糖可以明顯提高小鼠血清的SOD和CAT的活性以及降低血清MDA的含量,具有良好的抗氧化能力[25]。Li等研究發現蛹蟲草子實體多糖(CMP)能抑制線粒體損傷,清除活性氧,增加體內SOD、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)以及CAT的活性,從而具有抗衰老的功效[26]。本實驗結果顯示,CTP能顯著提高小鼠血液SOD和CAT的活性,并降低MDA的含量,表明其能提高機體抗氧化能力,有效預防機體的脂質過氧化,與上述文獻報道結果相似。

研究表明[27-28]多糖對免疫抑制狀態下的小鼠可通過抗氧化作用調節細胞內氧自由基水平,保護免疫系統細胞免受損傷,從而增強機體的免疫功能;本研究中CTP提高血清球蛋白含量進而增強小鼠免疫調節作用可能與抗氧化功能的增強相關,其機理有待進一步研究。

3 結論

本研究初步證實泰山蛹蟲草多糖能顯著降低環磷酰胺對小鼠的免疫抑制作用,提高環磷酰胺所致的免疫損傷小鼠的血清蛋白含量,對肝臟具有一定的保護作用,劑量為200mg/kg·bw的泰山蛹蟲草多糖的促進作用最為明顯;抗氧化研究表明,泰山蛹蟲草多糖可以通過提高一些抗氧化酶的活性和降低體內氧化反應產物的含量來提高機體的抗氧化能力。本研究為泰山蛹蟲草的開發利用及其多糖制劑的應用推廣提供理論依據和參考,同時多糖結構及構效關系方面的研究有待于進一步開展。

[1]李翠新,張國慶,何永珍,等. 野生蛹蟲草的分離與高產菌株的篩選[J]. 中國食用菌,2007,26(2):20-21.

[2]Yu R M,Wei Y,Song L Y,et al. Structural characterization and antioxidant activity of a polysaccharide from the fruiting bodies of cultured Cordycceps militaris[J]. Charbohydrate Polymers,2007,70:430-436.

[3]Chen C,Luo S S,Li Y,et al. Study on antioxidant activity of three Cordyceps sp. by chemiluminescence[J]. Shanghai Journal of Traditional Chinese Medicine,2004,38(7):53-55.

[4]Shih I L,Tsai K L,Hsieh C. Effects of culture conditions on the mycelial growth and bioactive metabolite production in submerged culture of Cordyceps militaris[J]. Biochemical Engineering Journal,2007,33:193-201.

[5]Lin Y W,Chang B H. Anti-tumor activity of the fermentation broth of Cordyceps militaris cultured in the medium of Radix astragali[J]. Process Biochemistry,2008,43:244-250.

[7]Das S K,Masuda M,Sakurai A,et al. Medicinal uses of the mushroom Cordyceps militaris:Current state and prospects[J]. Fitoterapia,2010,81:961-968.

[8]Zhou X W,Yi Y. Unexpected nephrotoxicity in male ablactated rats induced by Cordyceps militaris:The involvement of oxidative changes[J]. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine,2013,1:1-9.

[9]李樹鵬,趙獻軍. 黃芪多糖、益生菌合生元對雛雞生長和免疫的作用[J]. 中國農學通報,2005,21(6):51-57.

[10]劉立昌,張磊,鄧毅峰,等. 愈肝片對D-氨基半乳糖小鼠急性肝損傷的保護作用[J]. 廣州中醫藥大學學報,2003,20(1):57-58.

[11]江南,劉翠霞,但漢雄,等. 甘草酸二銨對大鼠環磷酰胺損傷的保護作用[J]. 中國臨床藥理學與治療學,2004,9(3):326-328.

[12]葉明霞,陶迎紅,周順長,等. 環磷酰胺致BALB/c小鼠肝損傷的組織學研究[J]. 實驗動物科學,2008,25(2):7-9.

[13]趙弋清,羅霞,陳東輝. 不同劑量環磷酰胺誘導正常小鼠免疫抑制的對比研究[J]. 免疫學雜志,2005,21(6):122-123.

[14]雷志明,于芳,鄒梅,等. 環磷酰胺對小鼠免疫功能的影響[J]. 衛生毒理學雜志,1989,3(2):108-109.

[15]周蓮娣,張起輝,李建春.吳茱萸對小鼠腸道黏膜相關淋巴組織影響的實驗研究[J]. 中醫藥學刊,2005,23(10):1848-1849.

[16]張大鵬,周聯,張志敏,等. 四君子湯復方總多糖對小鼠腸上皮間淋巴細胞的免疫調節作用[J].中藥新藥與臨床藥理,2009,20(3):204-206.

[17]朱凱. 蛹蟲草多糖分離純化及其對大鼠腎小球系膜細胞增殖的影響[D]. 長春:吉林大學,2007:24-33.

[18]蔣寧. 蛹蟲草多糖及蟲草素提取分離技術研究[D]. 南京:南京農業大學,2009:20-23.

[19]陳慰峰. 醫學免疫學(第4版)[M]. 北京:人民衛生出版社,2004:148-152.

[20]劉源,陸平成. 中藥復方頑疣凈對小鼠免疫器官重量和淋巴細胞轉化的影響[J]. 湖北中醫學院學報,2006,8(1):25-26.

[21]劉立昌,張磊,鄧毅峰,等. 愈肝片對D-氨基半乳糖小鼠急性肝損傷的保護作用[J]. 廣州中醫藥大學學報,2003,20(1):57-58.

[22]于震,王軍,李更生,等. 地黃苷A對環磷酰胺小鼠白細胞減少癥的影響[J]. 中草藥,2001,32(11):1002-1004.

[23]李樹鵬,趙獻軍. 黃芪多糖及益生菌合生元對雛雞腸道微生態區系的影響[J].家畜生態學報,2005,26(3):21-24.

[24]楊曉萍,羅祖友,吳謀成. 油菜花粉多糖的制備及其對荷瘤小鼠的影響[J]. 食品科學,2005,26(12):202-204.

[25]杜志強,楊晨晨,王建英. 猴頭菇多糖對小鼠血清抗氧化能力的影響[J]. 食品研究與開發,2011,32(9):56-58.

[26]Li X T,Li H C,Li C B,et al. Protective effects on mitochondria and anti-aging activity of polysaccharides from cultivated fruiting bodies of Cordyceps militaris[J]. The American journal of Chinese medicine,2010,38(6):1093-1106.

[27]陳炅然,胡庭俊,程富勝,等. 鬼臼多糖對免疫功能低下小鼠自由基產生酶活性的影響[J]. 動物醫學進展,2005,26(8):41-44.

[28]帥學宏,胡庭俊,陳炅然,等. 鬼臼多糖對小鼠免疫功能和抗氧化能力的影響[J]. 畜牧獸醫學報,2008,39(7):1000-1004.

Effect ofCordycepstaishanensispolysaccharide on protein content in serum and antioxidant activity in immunosuppressive mice

ZHANG Sheng-fang,ZHAO Long-yu,WANG Xue,ZHAO Feng-chun,YANG Zheng-you*

(Department of Microbiology,College of Life Science,Key Laboratory for Agriculture Microbiology,Shandong Agricultural University,Tai’an 271018,China)

Objective:To study the effects ofCordycepstaishanensispolysaccharide(CTP)on protein content in serum and antioxidant activity in immunosuppressive mice. Methods:Through gavage experiments in mice,the effects of CTP on the amount of total proteins(TP),albumin(ALB)and globulin(GLO)in serum and antioxidant activity were analyzed. Results:Compared with the CY model group,the amount of TP,ALB and GLO in serum were increased significantly(p<0.01),the activities of superoxide dismutase(SOD)in erythrocytes and catalase(CAT)in serum were significantly increased(p<0.05 orp<0.01)and the content of malondialdehyde(MDA)in erythrocytes were decreased significantly(p<0.01)in the three CTP treatment groups. Conclusion:CTP could significantly increase protein content in serum and reduce the damage at some level to liver function of immunosuppressive mice induced by CY. CTP could also improve antioxidant activity of CY-induced immunosuppressive mice to a certain extent.

Cordycepstaishanensispolysaccharide;cyclophosphamide;immunosuppressive mice;serum proteins;antioxidant activityinvivo

2014-08-25

張圣方(1989-),男,碩士研究生,研究方向:食品質量與安全。

*通訊作者:楊正友(1971-),男,博士,教授,研究方向:食品質量與安全,及食品微生物學。

國家自然科學基金(30972050,31271873);山東省自然科學基金(ZR2010CM015)。

TS201.4

A

1002-0306(2015)11-0332-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.11.059