不同分子量鹿茸多肽抗氧化活性的研究

劉春娟

(1.吉林省經濟管理干部學院,吉林長春130012;2.吉林大學生物與農業工程學院,吉林長春 130025)

不同分子量鹿茸多肽抗氧化活性的研究

劉春娟

(1.吉林省經濟管理干部學院,吉林長春130012;2.吉林大學生物與農業工程學院,吉林長春 130025)

本文利用膜分離技術獲得不同分子量段的鹿茸多肽,采用五種抗氧化檢測方法對其進行全面的抗氧化活性分析,獲得抗氧化活性較好的多肽Ⅲ片段,分子量在6214u以下。實驗結果表明,當濃度在0.1～10.0mg/mL范圍之間,多肽Ⅲ對超氧陰離子自由基清除能力和對還原能力低于VC;當濃度為10.0mg/mL時,多肽Ⅲ對DPPH自由基的清除能力與VC基本相當;當濃度在8.0～10.0mg/mL時,對羥自由基的清除率和對脂質體氧化抑制能力高于VC。

鹿茸多肽,抗氧化活性,不同分子量,膜分離技術

鹿茸是一種國內外常用名貴滋補品和中藥材。鹿茸中含有多種生物活性物質,在臨床上被用于多種疾病的治療。鹿茸多肽是鹿茸中重要的生物活性物質,具有免疫調節、抗氧化、抗疲勞、促進組織愈合和修復等作用[1]。目前獲得鹿茸多肽的方法以酶解鹿茸蛋白,分離純化降解產物為主[2-3]。因此運用現代化的科學技術從酶解液中分離多肽,尋找出具有代表性的生物活性物質,將對工業化生產具有深遠的意義。

本文首次利用膜分離技術將鹿茸蛋白酶解產物按分子量不同進行分段,獲得不同分子量段的鹿茸多肽,并采用多種抗氧化檢測方法測定其抗氧化活性,以期得到抗氧化活性較好的鹿茸多肽,為拓寬鹿茸的應用途徑——天然抗氧化劑,提供基礎理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

梅花鹿鹿茸(二杠,帶血茸) 購自長春市雙陽區梅花鹿養殖戶;Papain木瓜蛋白酶 丹麥諾維信公司;抗壞血酸(VC)為化學對照品 中國藥品生物制品檢定所;Gly-Gly-Tyr-Arg Sigma公司;DPPH(2,2-diphenyl-2-picrylhydrazy hydrate) Sigma公司;多肽分子量標準品(3496～14200u) 美國Amersham公司。

紫外可見分光光度計UV-2550 島津國際貿易有限公司;433D全自動氨基酸分析儀 德國SYKAM;DYY-8C電泳儀 DYCZ-24D電泳槽,北京市六一儀器廠;MSC300超濾杯 上海膜速科學器材有限公司;聚醚砜膜,膜面積0.002m2,截留分子量為10、5、3ku 北京安得膜分離技術工程有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品的制備 采用超高壓技術提取[4]鹿茸蛋白,經凍干得到鹿茸蛋白凍干粉。稱取鹿茸蛋白凍干粉進行酶解[5],將酶解液按分子量不同分成三段多肽,選用截留分子量為3、5、10ku的膜片,用分子量為0.2ku的膜片對3ku膜下液進行濃縮。得到三段分子量范圍為5～10ku的多肽Ⅰ,3～5ku的多肽Ⅱ,0.2～3ku的多肽Ⅲ。

1.2.2 多肽含量的測定 參照文獻[6]測定蛋白水解液中多肽的含量。

1.2.3 DPPH清除能力的測定 參照文獻[7]。用無水乙醇配制DPPH溶液2×10-4mol/L,避光,保存備用。精確吸取2mL樣品于試管中,加入2mL DPPH溶液,充分混合、搖勻,水浴(27℃)30min后倒入比色皿中,于517nm處測定其吸光度值Ai,同樣測定2mL樣品液和2mL無水乙醇的吸光度值Aj以及2mL DPPH溶液加入2mL蒸餾水的吸光度值A0。用蒸餾水作空白。DPPH自由基清除率(P)計算公式:

P(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100

平行測定三次,取平均值。

1.2.4 羥自由基清除能力的測定 參照文獻[8]。在干燥的試管中分別加入2.0mmol/L硫酸亞鐵溶液1.5mL、30mmol/L過氧化氫溶液1.5mL、6.0mmol/L水楊酸溶液1.5mL,振蕩,搖勻,于37℃水浴,15min后取出,在510nm處測其吸光度A0,然后加入樣液2.0mL,振蕩,搖勻,于37℃水浴15min后取出,測其吸光度A。清除率計算公式為:

清除率(%)=[(A0-A)/A0]×100

平行測定三次,取平均值。

1.2.5 超氧陰離子自由基清除能力的測定 參照文獻[9]。在干燥的試管中加入4.5mL 0.05mol/L的Tris-HCL緩沖溶液(pH8.2),4.0mL去離子水,0.2mL待測樣液,混勻后,置于25℃恒溫水浴10min。取出后迅速加入0.3mL(25℃溫浴10min)的鄰苯三酚溶液(3mmol/L,10mmol/L HCL配制),混勻后立即在320nm下測定,每隔30s測定1次吸光度值,記錄4min內吸光度值的變化,并求出其變化斜率,用10mmol/L HCL代替鄰苯三酚做空白調零。用去離子水代替樣品溶液同樣方法測定4min內吸光度值的變化,并求出其變化斜率。平行測定三次,取平均值。清除率計算公式為:

清除率(%)=[(k0-k)/k]×100

式中:k0為空白管吸光度值變化斜率;k為樣品管吸光度值變化斜率。

脂質體氧化抑制率P(%)=[(A0-Ai)/A0]×100

1.2.7 還原能力的測定 參照文獻[15]。吸取樣品液2mL于試管中,加入2mL磷酸鹽緩沖液(0.2mol/L,pH6.6)和2mL鐵氰化鉀溶液(1%)。充分混勻,放置于50℃水浴20min,冷卻到室溫后,然后在反應混合物中加入2mL三氯乙酸溶液(10%),混合后離心(3000r/min)10min,取上清液2mL,加入2mL蒸餾水及0.4mL三氯化鐵溶液(0.1%),反應10min后,測定其在700nm處的吸光度值,樣品還原能力越強,吸光度值就會越大。平行測定三次,取平均值。

1.2.8 Tricine-SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(Tricine-SDS-PAGE) 采用小分子多肽常用的電泳分析法Tricine-SDS-PAGE電泳[16-17]。將樣品與緩沖液按一定比例混合,取上清液10μL進行分析。

1.2.9 氨基酸組分測定 采用氨基酸自動分析儀測定水解液中氨基酸的含量,具體測定方法參照GB/T 18246-2000。

2 結果與分析

2.1 不同分子量鹿茸多肽DPPH自由基清除能力

DPPH是一種穩定的以氮為中心的自由基,其乙醇溶液呈紫色,在517nm附近有強吸收,當有自由基清除劑加入DPPH溶液時,溶液顏色變淺,吸收減弱,吸收減弱的程度可以評價某種活性物質的抗氧化能力,DPPH自由基的清除率越大,說明物質的抗氧化能力越強[18-20]。測定不同濃度的多肽Ⅰ、多肽Ⅱ、多肽Ⅲ對DPPH自由基的清除率,與VC進行比較,由圖1可以看出,VC對DPPH自由基的清除率非常高,多肽Ⅰ、多肽Ⅱ、多肽Ⅲ對DPPH自由基的清除能力,在低濃度時明顯弱于VC,當多肽濃度為10.0mg/mL時,多肽Ⅲ與VC對DPPH自由基的清除能力基本相當。

圖1 DPPH自由基清除能力比較Fig.1 Comparison of DPPH radical scavenging ability

2.2 不同分子量鹿茸多肽羥自由基清除能力

采用水楊酸比色法測定羥自由基清除能力,根據Fenton反應原理,反應體系中的水楊酸能捕捉·OH,生成在510nm處有最大吸收峰的有色物質,吸光值與·OH的量成正比,如果向反應體系中加入具有清除·OH能力的物質,會減少水楊酸和·OH的結合,吸光值降低,即可測出被測物·OH清除率。由圖2可以看出,三種多肽段對羥自由基清除能力在0.1～10.0mg/mL濃度范圍內,隨著多肽濃度的增加而增大。其中在高濃度8.0～10.0mg/mL下,多肽Ⅲ對羥自由基的清除率高于VC,表現出了較強的對羥自由基的清除能力。

圖2 羥自由基清除能力比較Fig.2 Comparison of hydroxyl radicals scavenging ability

2.3 不同分子量鹿茸多肽超氧陰離子自由基清除能力

圖3 超氧陰離子自由基清除能力比較Fig.3 Comparison of superoxide anion radical scavenging ability

2.4 不同分子量鹿茸多肽脂質體氧化抑制能力

脂質體氧化法是一種模擬細胞膜脂質氧化的體外實驗方法。鹿茸多肽對脂質體氧化抑制能力結果如圖4所示。當多肽濃度超過4.0mg/mL之后,多肽Ⅱ和多肽Ⅲ對脂質體氧化抑制能力高于VC。研究顯示蛋白質(多肽)的乳化性與分子中疏水性基團的數量、種類及其在分子中分布有關。酶水解作用可能導致緊密的蛋白質分子構象被破壞,從而使被包埋于分子內部的疏水性氨基酸側鏈基團暴露出來,易于與脂類結合,形成穩定的乳化體系[22]。相對水溶性的VC來說,有良好的乳化性能的多肽能夠有效抑制卵磷脂分散體系中脂質體過氧化。

2.5 不同分子量鹿茸多肽還原能力

采用普魯士藍反應法測定鹿茸多肽的還原能力。在還原劑(樣品)的作用下,K3Fe(CN)6被還原成K4Fe(CN)6,然后會與Fe3+反應形成普魯士藍K4(Fe(CN)6)3,普魯士藍在700nm處有最大吸收峰,其吸光度值越高,普魯士藍的生成量越大,表明還原劑還原能力越強[23]。 由圖5可知,在0.1～10.0mg/mL濃度范圍內,三種多肽段的吸光度值明顯低于同濃度的VC,說明三種多肽段的還原能力相對于VC來說比較差。

圖4 脂質體氧化抑制能力比較Fig.4 Comparison of liposome oxidation inhibitory ability

圖5 還原能力比較 Fig.5 Comparison of reducing power

2.6 Tricine-SDS-PAGE電泳結果分析

SDS-PAGE利用蛋白質分子量不同對其進行分離,是一種經濟、快速、易于操作且可重復的方法,現已成為在許多研究領域中一種重要的分析技術。鹿茸多肽(多肽Ⅰ、多肽Ⅱ、多肽Ⅲ)Tricine-SDS-PAGE電泳圖譜見圖6。從圖中可以看到,在6000u到10000u附近,多肽Ⅰ條帶較清晰;多肽Ⅱ分子量集中在3496u到8159u之間;抗氧化性相對較好的多肽Ⅲ因為分子量較小,分離效果不理想,但從圖中可以看出主要部分的分子量在6214u以下。

圖6 鹿茸多肽Tricine-SDS-PAGE電泳圖譜Fig.6 Tricine-SDS-PAGE analysis of velvet antler peptide注:M-標準蛋白;1-多肽Ⅰ;2-多肽Ⅱ;3-多肽Ⅲ。

2.7 鹿茸多肽氨基酸組成分析

從不同體外抗氧化實驗的結果中可以看出,總體抗氧化能力最強的組分是多肽Ⅲ。對其氨基酸組成進行測定分析,結果如表1。檢測結果為氨基酸占總固形物的百分含量。

表1 多肽Ⅲ氨基酸組成Table 1 Composition of amino acid of peptide Ⅲ

有文獻研究顯示許多氨基酸及其衍生物具有抗氧化能力,如Leu、Gly、Ala、Glu、Asp、His、Tyr等。其中由于抗氧化肽具有Ala、Val、Leu疏水性的非極性脂肪烴側鏈,加強了其與疏水性多不飽和脂肪酸相互作用,含有這些疏水性氨基酸的多肽能夠通過與氧的結合,抑制脂質中氫的釋放,脂質過氧化鏈反應被延緩,從而對脂質體系起到保護作用,起到抗氧化的作用[24]。由表1可以看出,多肽Ⅲ中三種氨基酸:Leu含量為7.69%,Glu含量為6.15%,Gly含量為5.01%,相對而言含量非常高,因此多肽Ⅲ在脂質體氧化抑制能力的測定時顯現出較強的抑制力。

3 結論

通過五種方法比較不同分子量大小鹿茸多肽的抗氧化活性,發現分子量最小的鹿茸多肽Ⅲ具有最高的抗氧化活性,分子量在6214u以下。體外抗氧化活性實驗研究顯示,當濃度在0.1～10.0mg/mL范圍之間,多肽Ⅲ對超氧陰離子自由基清除能力和對還原能力低于VC;當濃度為10.0mg/mL時,多肽Ⅲ對DPPH自由基的清除能力與VC基本相當;當濃度在8.0～10.0mg/mL時,對羥自由基的清除率和對脂質體氧化抑制能力高于VC。因此鹿茸多肽Ⅲ具有成為一種天然抗氧化劑的潛力。

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Study on antioxidant activity of antler peptideswith different molecular weight

LIU Chun-juan

(1.Jilin Province Economic Management Cadre College,Changchun 130012,China;2.College of Biology and Agriculture Engineering,Jilin University,Changchun 130025,China)

Antler peptides with different molecular weight cutoff were prepared by membrane technology and their antioxidant activities were evaluated by five kinds of methods. The results indicated that the antioxidant activity of peptide III was the best,and its molecular weight was less than 6214u. The ability of O-2·free radical scavenging and the reducing of the peptide III were weaker than that of VCwhen their concentration was in the range of 0.1～10.0mg/mL,and the ability of DPPH· free radical scavenging of the peptide III was the same as VCwhen their concentration was 10.0mg/mL. But the ability of hydroxyl radicals scavenging and the liposome oxidation inhibition of the peptide III were higher than that of VCwhen their concentration was in the range of 8.0～10.0mg/mL.

velvet antler peptides;antioxidant activity;different molecular weight;membrane technology

2014-09-02

劉春娟(1977- ) ，女，博士，副教授, 研究方向：從事食品及天然產物的研究與開發。

國家自然科學基金項目( 30472135);長春市科技支撐計劃項目(08KZ35)。

TS202.1

A

1002-0306(2015)13-0053-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.13.002