β環糊精葡萄糖基轉移酶突變基因的表達及突變酶酶學性質分析

王 華,李 華

(內蒙古民族大學生命科學學院,內蒙古通遼 028000)

王 華,李 華*

(內蒙古民族大學生命科學學院,內蒙古通遼 028000)

通過對已構建的β-CGTase質粒載體采用一步PCR法進行大片段基因的定點突變,得到三個帶有突變位點的質粒載體,并將其進行轉化得到突變菌株。分析突變酶的酶學性質并與β-環糊精葡萄糖基轉移酶比較,結果表明突變酶酶活力提高到原酶活力的1.6倍以上,且突變酶作用的最適溫度60℃、最適pH6.0、在60℃下和pH5～8范圍內均非常穩定,經方差分析突變酶與原酶的酶學性質差異不顯著(p>0.05),但是酶活力差異顯著(p<0.05)。

β-環糊精葡糖糖基轉移酶,定點突變,環化活性,溫度,pH

β-環糊精葡萄糖基轉移酶(β-CGTase)屬于α-淀粉酶家族,可以作用于淀粉的葡萄糖單位通過α-1,4-糖苷鍵連接而生成β-環糊精(β-CD)。β-CD的化學結構具有非極性空穴和外親水的特點,常被用作分子膠囊和乳化劑,廣泛應用于食品、醫藥、化妝品、農藥等領域[1-2]。β-CGTase是催化淀粉發生環化反應生成β-CD的關鍵酶。

天然的β-CGTase主要來源于芽孢桿菌(Bacillaceae)[3],由于其發酵分泌產生的β-CGTase的產量較低從而使得酶法生物轉化β-CD效率低[4]。隨著基因工程技術的發展β-CGTase已被分離純化,相應的酶的編碼基因(cgt基因)也得到了克隆表達[5]。關于β-CGTase基因研究已有很多報道,基因序列中含有一個780bp的開放閱讀框,由259個氨基酸組成的多肽鏈,分子量在70ku左右[6]。與此同時,基因工程定點突變技術廣泛應用于酶的體外改造中,通過改變酶的基因序列來改變酶與底物的結合能力,從而改變酶的活性。Shin Hyun-Dong等[7]人利用定點突變技術將β-CGTase基因中W652突變成G,結果表明酶的環化活性增強而水解及偶合活性降低。通過對來自B,circulans 251中的環糊精轉移酶進行突變Ala230Val,使該酶的水解活性提高而環化活性降低[8]。因此,通過增強酶與底物的結合能力來提高酶法生物轉化β-CD效率成為目前研究的熱點。

表1 PCR定點突變所用引物Table 1 Primer pairs with PCR site-directed mutagenesis

本實驗是在根據β-CGTase基因序列的晶體結構,在SWISS-MODEL上建模,分析得到β-CGTase保守區內影響到酶環化活性的幾個突變位點Y127,R254,D355,一步PCR法進行大片段基因的定點突變,并在大腸桿菌中得到異源表達,對突變酶進行酶學性質分析,為酶法生物轉化β-CD效率的提高提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株EscherichiacoliBL21(DE3) 上海光明乳業有限公司技術中心惠贈,重組表達質粒pET-28b::CGTase為上述技術中心構建。La Taq聚合酶/限制性內切酶NcoI、XhoⅠ以及分子量標準250 bp DNA Ladder Marker、DL10000 DNA Marker 均購自TaKaRa公司。

硫酸卡那霉素,Triton X-100,甘氨酸,可溶性淀粉 均購于北京鼎國;常規化學試劑 均為國產分析純試劑。

發酵培養基:酵母粉10g,玉米漿20g,淀粉10g,K2HPO41g,MgSO4·7H2O 0.2g,調pH8.0。另配20% Na2CO3單獨滅菌,接種時每100mL培養基中加入2mL。

ABI PCR擴增儀 Applied Biosystems;凝膠成像系統 DNr MiniBis pro。

1.2 實驗方法

1.2.1 突變酶表達載體的構建 根據β-CGTase基因序列的晶體結構,在SWISS-MODEL上建模,通過對β-CGTase基因和3個突變氨基酸相應位點及其兩側的堿基序列進行分析,使用軟件Primer premier 5.0設計一對β-CGTase的引物和3對突變引物(見表1)。

以質粒pET-28b::CGTase為模板,以突變引物為引物,體系中加入La Taq 聚合酶,設定擴增各個帶有突變基因的質粒程序:94℃,90s;98℃,10s:68℃,10min,30個循環;72℃,10min;4℃保溫[9-11]。PCR擴增后,利用熱擊法將克隆載體轉化到E.coliBL(21)中,在含有100mg/mL卡那霉素的LB平板上進行藍白斑篩選,挑取白色單菌落進行液體擴大培養,經過菌液PCR檢測及質粒雙酶切鑒定片段大小正確后,將陽性菌株送上海生工進行基因測序。

1.2.2 粗酶液的制備 分別將測序正確的突變菌株接種于含有10μg/mL硫酸卡那霉素的LB液體培養基,37℃過夜震蕩培養;取上述菌液按1∶30的比例接種于新鮮的發酵培養基(含有10μg/mL硫酸卡那霉素)中,37℃振蕩培養8h,然后加入1%乳糖過夜誘導表達,再加入終濃度分別為0.5%和1%的Triton X-100和甘氨酸繼續震蕩培養8h后,7000r/min、4℃離心10min,上清即為粗酶液。

1.2.3 突變酶的酶活分析——藍值法 取0.01mL適當稀釋的粗酶液,加0.2mL pH9.0 Gly-NaOH緩沖溶液,再加入現配現用的0.2%馬鈴薯淀粉溶液0.2mL,40℃反應10min,立即加入0.5mL 0.5mol/L冰醋酸終止反應,加入3mL 0.005%碘溶液顯色,以不加酶液溶液的反應液作空白對照,在700nm測定吸光度OD值。將一個酶活力單位定義為藍值下降10%所需的酶量[12]。

注:式中a為對照組OD值,b為樣品OD值

1.2.4 pH對酶活及酶穩定性的影響 將酶在pH4.0～11.0的不同緩沖液中按方法1.2.2測定其對應的酶活力。調節pH的緩沖液:乙酸-乙酸鈉緩沖液pH4.0～5.0,Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液pH6.0～8.0,甘氨酸-NaOH緩沖液pH9.0～11.0。

將酶在pH4.0～11.0的不同緩沖液中室溫下放置1h后,按方法1.2.3測定各突變體表達酶的活力[12]。以在最適反應pH下所測得的酶活力為100%。

1.2.5 溫度對酶活及酶穩定性的影響 將酶液分別在30～80℃下按方法1.2.3測定酶液的活力。

在pH6.0的磷酸鹽緩沖液中,將酶液在不同溫度下保溫1h后,按上述方法測定相對酶活[13]。以在最適反應溫度下保溫所測得的酶活力為100%。

1.2.6 突變酶的酶動力學參數的測定 取100μL經過純化的突變酶(質量約為0.5μg),加入200μL 0.2mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.0),再分別加入0.4～6.0mg/mL玉米淀粉溶液,60℃反應10min后測定其酶活力[14-15]。用Linewear-Burk 作圖法得出突變酶對底物淀粉的Km、Vmax、kcat和kcat/Km的數值。

2 結果與分析

2.1 β-CGTase突變表達載體的構建

以F、R為引物,以陽性克隆質粒為模板進行PCR擴增。經1%瓊脂糖凝膠電泳分析,在大約2.1kb處有一條很亮的擴增條帶,如圖1。以質粒pET-28b::CGTase為對照,對三個突變表達載體Y127F、R254F、D355R經限制性內切酶NcoI和XhoⅠ雙酶切,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,突變體在2139bp和5368bp處有特異性條帶,如圖2所示。將酶切與PCR鑒定正確的突變質粒菌株送往上海生工進行核苷酸序列測定,測序引物為通用引物:T7。測序結果經DNAMANDNAMAN-Align比對,證實了相應的氨基酸序列也得到了預期突變,分析結果見圖3。圖中灰色部位即為突變位點的氨基酸位點。

圖1 不同突變體的突變基因片段擴增電泳分析Fig.1 Electrophoresis of the amplified fragment of different mutants注:M:250bp Marker(250,500,750,1000,1500,2250,3500,4500bp);1:pET-28b::CGTase;2:Y127F;3:R254F;4:D355R。

圖2 突變質粒雙酶切鑒定Fig.2 Identification of mutation by restriction enzymes注:M:DL10000 Marker(250,500,1000,2000,4000,7000,10000bp);1:pET-28b::CGTase質粒;2:pET-28b::CGTase質粒酶切;3:Y127F質粒;4:Y127F質粒酶切;5:R254F質粒;6:R254F質粒酶切;7:D355R質粒;8:D355R質粒雙酶切。

圖3 β-CGTase基因序列與突變基因序列多重序列比較Fig.3 Multiple alignment of the amino-acid sequences of β-CGTase and mutants

2.2 pH對酶活及其穩定性的影響

如圖4a所示,不同pH反應下出發菌株pET-28b::CGTase及突變菌株p-YF、p-RF和p-DR的粗酶液的β- CGTase的活力。由圖可見,隨著pH的升高,酶活力逐漸增大,在弱酸(pH6.0)條件下各菌株的酶活力均達到最大酶活,當繼續增大pH活力反而降低,因此確定突變菌株與出發菌株的β- CGTase的最適反應pH一致,即酶的最適反應pH是6.0。

圖4 pH對β-CGTase活力及其穩定性的影響 Fig.4 pH-activity profiles and stability of β-CGTase 注:圖a為pH對β-CGTase活力的影響;圖b為pH對β-CGTase穩定性的影響。

將酶液與不同pH的緩沖溶液混合室溫下放置1h,在60℃下測定出發菌株與突變菌株產β-CGTase的酶活力,如圖4b所示,β-CGTase在pH5.0～8.0較廣pH范圍內均較穩定,酶活力都在90%以上,這一性質與出發菌株保持一致,經方差分析,pH對各酶穩定性影響差異不顯著(p>0.05)。

2.3 溫度對酶活及其穩定性的影響

不同反應溫度下出發菌株pET-28b::CGTase及突變菌株p-YF、p-HC、p-RF和p-DR的粗酶液的β-CGTase的活力如圖5a。由圖可見,隨著反應溫度的升高,酶活力逐漸增大,當溫度在60℃各菌株的酶活力均達到最大酶活,當繼續升高溫度酶活反而降低,因此確定突變菌株與未突變的菌株的β-CGTase的最適反應溫度一致,即酶的最適反應溫度為60℃。

將酶液在不同溫度下保溫1h后,在60℃下測定出發菌株與突變菌株產β-CGTase的酶活力,如圖5b所示,β-CGTase在60℃下保溫1h后酶活力仍然保持在90%以上,超過60℃酶活力逐漸降低。表明突變菌株p-YF、p-HC、p-RF和p-DR在60℃下具有一定的耐熱性,這一耐熱性與出發菌株保持一致。經方差分析,溫度對各酶穩定性影響差異不顯著(p>0.05)。

表2 pET-28b::CGTase和突變菌株p-YF、p-RF和p-DR的動力學參數Table 2 Kinetic parameters of β-CGTase and mutants

圖5 溫度對β-CGTase活力及穩定性的影響Fig.5 Temperature-activity profiles and stability of β-CGTase 注:圖a為溫度對β-CGTase活力的影響; 圖b為溫度對β-CGTase穩定性的影響。

注:*差異顯著(p<0.05);a表示各突變酶與pET-28b::CGTase相對酶活的比值。

2.4 β-環糊精葡萄糖基轉移酶及突變酶的動力學參數

以玉米淀粉濃度的倒數為橫坐標,反應速度的倒數為縱坐標,作雙倒數曲線為,如圖6所示。其中x為底物玉米淀粉濃度的倒數,y為反應速度的倒數。根據 Linewear-Burk 雙倒數作圖法求得酶以玉米淀粉為底物時的Km為和Vmax,結果見表2。

圖6 β-CGTase的雙倒數曲線Fig.6 Lineweaver-burk plot of β-CGTase

由圖6和表2的結果可以得出,與出發菌株相比突變菌株產β-CGTase的Km值較低,其Vmax稍有提高。根據催化效率可以簡單的解釋這個變化。

催化效率=Kcat/Km

kcat-酶的轉換數,是指酶被底物飽和時,單位時間(/S)內單個酶分子與底物作用并轉換底物的分子數。kcat等于Vmax與酶的總濃度的比值。

由表2可知,突變酶與原酶的Vmax相差非常小,因此它們的kcat相差也非常小,所以由上式可知突變酶較小的Km值應該具有較大的催化效率。同時,Km值的大小就可以表示酶與底物之間親和力的強弱,Km值越小親和力越強。由此可知,經過突變后得到的菌株分泌產生的β-CGTase與底物玉米淀粉的親和性提高,這個結論與藍值法檢測酶活力的結果是一致的(表2),即突變酶活力與原酶活力差異顯著(p<0.05)。

3 結論與討論

實驗表明,通過對β-CGTase突變基因的表達并對各突變菌株的酶學性質進行分析,證實了突變菌株p-YF、p-RF和p-DR分泌產生的β-CGTase反應的最適溫度為60℃、最適pH為6.0,與原酶保持一致。且通過方差分析得知,溫度、pH對突變酶與原酶的穩定性的影響差異不顯著(p>0.05)。

通過實驗得知,突變酶的酶反應動力學常數Km值發生了改變,與原酶相比突變酶的Km值均減小,而這說明定點突變沒有改變酶的催化特征,而是提高了酶與底物淀粉的親和力從而提高了(-CGTase突變酶環化活力。這個結論與藍值法檢測酶活力的結果是一致的,突變酶的環化活力提高至原酶環化活力的1.6倍以上,其中突變酶Y127F的活力約達到原酶活力的2.1倍。經方差分析,突變酶環化活力與原酶環化活力差異顯著(p<0.05)。因此,可以推斷突變酶環化活力的提高是由于酶與底物玉米淀粉的親和力的提高所引發的。

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Study on mutant gene expression of β-CGTaseand its enzymology characteristics analysis

WANG Hua,LI Hua*

(College of Life Science,Inner Mongolia University for Nationnalities,Tongliao 028000,China)

Using one-step PCR,three amino acid residues Y127,R254 and D355 within the conserved protein domain of β-cyclodextrin glucosyl transferase were subjected to site-directed mutagenesis,and the mutant plasmids were transformed intoEscherichiacoliBL21(DE3)for effective expression,respectively. The result showed that the activity of mutant enzymes was 1.6 times higher than initial enzyme. The mutant enzymes were optimal at 60℃ and pH6.0,and that the enzymes were stable for at least 60min at 60℃ and across a wide pH5.0～8.0,the enzymatic properties existed no significant difference among mutant enzymes and initial enzyme(p>0.05),but there existed significant difference about activity between mutant enzymes and initial enzyme(p<0.05).

β-cyclodextrin glucosyl transferase;site-directed mutagenesis;cyclization activity;temperature;pH

2014-09-17

王華(1981-),女,博士,副教授,主要從事功能性食品與生物反應器的研究。

*通訊作者:李華(1967-),女,學士,教授,主要從事食品營養的研究。

內蒙古民族大學國培項目(NMDGP1413)。

TS202.3

A

1002-0306(2015)13-0180-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.13.029