貴州荔波傳統酸肉優勢菌篩選、鑒定與發酵性能研究

張 倩,郭曉蕓,范麗平,王 艷,楊冬梅

(1.杭州萬向職業技術學院生物技術系,浙江杭州 310023;2.貴州省畜牧獸醫學校,貴州貴陽 550051)

貴州荔波傳統酸肉優勢菌篩選、鑒定與發酵性能研究

張 倩1,郭曉蕓2,范麗平1,王 艷1,楊冬梅1

(1.杭州萬向職業技術學院生物技術系,浙江杭州 310023;2.貴州省畜牧獸醫學校,貴州貴陽 550051)

目的:為揭示貴州荔波傳統酸肉不同發酵期微生物菌群變化特征,確定優勢菌種,并了解其發酵性能。方法:對酸肉中的菌種進行分離、篩選,采用API 50CH標準系統進行鑒定,并對優勢菌的生長特性、產酸性、耐鹽性、酶活力等進行研究。結果:篩選出四株產酸較快、發酵風味好的乳酸菌分別是M5-4-2、M1-4、M3-4、M9,其中兩株為短乳桿菌,另外兩株分別是植物乳桿菌和乳酸乳球菌乳酸亞種,四株菌均有較高的耐鹽特性和較強的亞硝酸鹽耐受能力,四株菌株之間無拮抗性、均能發酵葡萄糖產酸而不產氣、胞外酶均無蛋白質和脂肪分解能力。結論:M5-4-2、M1-4、M3-4、M9發酵性能較好,可以復配混合,開發為荔波酸肉產業化生產的純種發酵劑。

酸肉,發酵,優勢菌,發酵性能

貴州荔波傳統酸肉是貴州省荔波縣布依族特色性的發酵肉制品,由于風味獨特、營養豐富、色鮮味美而成為當地少數民族喜愛的一種民間發酵肉制品。目前,有關其他地區的發酵酸肉方面的研究報道較多,研究者們主要從酸肉的產品特性[1]、微生物菌種在發酵期的變化與分離鑒定[2-5]以及發酵期發酵條件[6]進行研究,然而對貴州荔波傳統酸肉加工過程中微生物特性缺乏系統深入的研究,致使酸肉加工過程中的一些關鍵性技術問題無法解決,生產現狀仍然停留在民間作坊式生產,即無優質發酵劑、無統一的加工技術標準,其質量也受到一定的影響,在一定程度上限制了酸肉的大規模現代化生產;國內外對發酵肉的微生物菌相變化、找出產品中的優勢菌群并篩選性能優良的微生物菌種、從而開發肉用人工發酵劑的研究已有學者關注和研究,但主要集中在香腸制品的研究上[7-12],生產發酵肉制品所使用的微生物發酵劑多數還依賴進口。因為是自然發酵的肉制品,其中含有多種有益微生物,是肉類專用發酵劑的重要生物資源,具有巨大開發潛力[13-14]。正是這種巨大的市場開發潛力,有必要對不同地域的傳統“酸肉”發酵體系中微生物的動態變化進行分析。為此,對貴州荔波當地傳統酸肉發酵過程中不同階段肉制品的各種微生物指標的變化情況進行觀察,分析其變化規律,確定發酵期的優勢菌及其發酵性能,以期為貴州荔波傳統酸肉工業化發酵過程控制以及酸肉產品質量的提高提供依據。探明酸肉制品的各種特性與發酵菌種的相關性;揭示傳統酸肉中微生物之間的生態關系以及不同微生物對傳統酸肉品質的影響,在此基礎上確定益酵菌株,為貴州荔波傳統酸肉的進一步開發利用并實現工業化生產提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

荔波酸肉 取自貴州荔波當地生產銷售量最大的兩種壇裝傳統自然發酵酸肉,分別記為A、B 兩個處理組,每個處理組樣品總量為3.5kg(0.35×10壇)。從入壇發酵開始,發酵60d內每隔10d分別從2個處理組中隨機抽出1壇,進行菌種分離鑒定與發酵性能研究。

PCA培養基、PDA(Potato Dextrose Agar)和VRBDA(Violet Red Bile Dextrose Agar)培養基 杭州微生物試劑有限公司;MRS培養基、Baird-Parker Agar培養基 北京路橋科技有限責任公司。

XSZ-21光學顯微鏡 北京金紫光科技發展有限公司;SWCJ-1FD型單人單面凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司;LDZM-50 立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠;SHP-250智能生化培養箱 上海光度儀器設備有限公司;BS110S電子天平 北京賽多利斯天平有限公司;HI-98128型袖珍型防水pH計 廣州市盛華化工科技有限公司;CS101-2型電熱鼓風干燥箱 重慶實驗設備廠制造。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗條件

1.2.1.1 樣品采集及處理 取樣參照GB/T4789.17-2003進行,用無菌剪刀剪取傳統酸肉(取多個部位的)25g,放入滅菌研缽內用無菌剪刀剪碎后,加滅菌石英砂研磨,磨碎后加入滅菌水225mL,混勻后即為l:10稀釋液。然后取1mL 加入到9mL 無菌生理鹽水中,即成10-2稀釋度,根據需要再依次制成不同的稀釋度。選擇合適稀釋度采用平板計數法進行計數。

1.2.1.2 荔波酸肉發酵期各類微生物的數量測定 采用PCA平板30℃,72h測定菌落總數;MRS(de Man,Rogosa,Sharpe Agar)30℃,72h測定乳酸細菌數、優勢菌鑒定及發酵性能研究;改良型MRS即在MRS培養基中添加0.2%(w/v)的無菌山梨酸鉀,30℃,72h測定乳酸桿菌;VRBD(Violet Red Bile Dextrose Agar)37℃,24h測定腸菌落總數;MSA(Mannital Salt Agar)30℃,72h測定微球菌和葡萄球菌;Baird-Parker Agar 30℃,48h測定病原性葡萄球菌;改良PDA(Potato Dextrose Agar)即加入0.2%(v/v)濃度為10%的無菌酒石酸,28℃,72h測定酵母菌及絲狀真菌[15]。

1.2.1.3 優勢菌分離、篩選、鑒定 優勢菌分離、篩選 劃線分離,從計數平板表面及內部挑取外觀形態不一樣的菌落,在相應平板上劃線培養,得到純菌落進行鑒定,具體操作方法參照《微生物學實驗手冊》[16]。在30℃下液體培養,選出產酸速度較快、產酸量大的菌株,再把這些菌株按5%的接種量接種到鮮肉湯里進行發酵,篩選出產酸速度快、發酵風味好的菌株,并于60%甘油中于-18℃下冷凍保存。

菌種鑒定 形態觀察:形態觀察的具體操作方法參照《微生物學實驗手冊》[16]。菌落形態:菌落形狀和大小、邊緣、表面、隆起形狀、透明度、菌落及培養基的顏色等。細胞形態:細胞形狀和排列方式,用顯微鏡油鏡觀察;革蘭氏染色:革蘭氏染色的具體操作方法參照《微生物學實驗手冊》[16];全自動微生物分析鑒定:根據Analytic Products NC(API)細菌鑒定標準,利用API CHL培養基和API50CH試劑條對篩選出的菌株進行糖發酵反應,并經APILAB Plus自動判讀系統(版本5.0)鑒定各菌株。

1.2.1.4 優勢菌發酵性能研究 根據肉制品對益酵菌株要求,分別對優勢菌的發酵特性進行以下研究。生長曲線測定:參照王永霞等(2004年)方法[17];產酸特性:參照金世琳(1998年)方法[18];耐鹽性:參照金世琳(1998年)方法[18];耐亞硝酸鹽性:參照金世琳(1998年)方法[18];拮抗性:參照李先保(1997年)方法[19];發酵葡萄糖產氣:參照金世琳(1998年)方法[18];致死溫度:參照紀建業(2005年)方法[20];脂肪酶活力:牛津杯法參照金世琳(1998年)方法[18]、分光光度定量測定法參照張寒俊等(1998年)方法[21];蛋白酶活力:牛津杯法參照金世琳(1998年)方法[18];紫外光譜定量測定法參照李先保(1997年)方法[19]。

1.3 數據統計分析

所有數據均做平行實驗,采用SPSS13.0統計分析軟件(SPSS Inc.,Chicago,Illinois,USA)對所得的定量數據進行方差分析(one-way ANOVA)和 Tukey分析(p<0.05)。

2 結果與討論

2.1 微生物菌種變化特征

以傳統酸肉在發酵的同一時期內各主要菌種數量的平均值為縱坐標,發酵時間為橫坐標作圖(圖1所示)。

表1 四株菌的形態學特征Table 1 The morphological character of four bacteria strains

圖1 荔波傳統酸肉發酵過程中微生物的變化Fig.1 Changes of microorganism flora during fermentation of Libo sour meat

由圖可知,除腸細菌在發酵的全過程中呈下降的趨勢外(食鹽對其生長有抑制作用),所有的微生物菌群在發酵的前20d內均有一個生長繁殖的過程。乳酸細菌在酸肉制品中有重要作用,發酵開始之前,原料中菌落總數要高于其他微生物菌系的數量。當乳酸細菌數量達到最高點時,各類微生物均受到一定程度的影響。其中對菌落總數的影響最為明顯,在發酵20d前后,乳酸細菌數量超過其他微生物,之后高濃度的乳酸細菌有所下降。乳酸細菌還可在短期內(發酵20、30d)影響微球菌、腸球菌和酵母菌的生長,也影響了芽孢桿菌的生長。酵母菌總數在發酵的全過程中無顯著變化。

2.2 優勢菌分離鑒定

酸肉中的優勢菌主要是乳酸菌[14],對荔波傳統酸肉樣品進行系列稀釋后在MRS培養基平板上進行菌株分離,初步分離出菌株30株,經過革蘭氏染色鏡檢、接觸酶反應、30℃下培養液中發酵產酸的比較,篩選出20株革蘭氏陽性、接觸酶陰性、產酸較快的菌株,再進行30℃下培養液中發酵產酸的比較,結果選出四株產酸較快、發酵風味較好的菌株M5-4-2、M1-4、M3-4、M9,其形態學特征見表1。

經過API CHL培養基和API 50 CH試劑條對四株菌進行49種糖發酵反應,并用APILABPlus自動判讀系統對其進行鑒定,鑒定結果為:M3-4和M9為短乳桿菌(Lactobacillusbrevis),鑒定值分別為99.9%和92.1%。M5-4-2為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum),鑒定值為99.9%。M1-4為乳酸乳球菌乳亞種(L.lactissubsp.Lactis)鑒定值為81.4%。

2.3 優勢乳酸菌發酵性能研究

對以上分離出的四株乳酸菌進行了一系列性能測定:對菌株進行生長曲線的測定以了解其生長周期及生長情況;對不同pH的適應性是衡量菌種在不同酸堿條件下活動能力的一項重要指標,合適的發酵溫度可以兼顧發酵的快速進行,同時確保發酵原料的質地和口感;菌種對不同鹽量的適應能力則可拓展菌種應用范圍從而滿足不同地區對不同鹽量的要求。

2.3.1 生長曲線特征 由圖2可以看出,將四株乳酸菌接種于MRS液體培養基,在30℃條件下培養38h的過程中,M5-4-2、M3-4、M9這三株菌16h進入穩定生長期,而M1-4在20h后進入穩定生長期。其中M3-4和M9這兩株菌的生長基本相同。

圖2 四株乳酸菌的生長曲線Fig.2 Growth curve of four Lactobacillus

2.3.2 產酸特性 良好的肉品發酵劑應具有較好的發酵產酸特性,通過發酵產酸使發酵肉制品的pH降低,形成酸性環境,抑制病原微生物的增殖和毒素的產生。為快速啟動發酵,防止雜菌污染、繁殖,保證產品風味和食用安全性,發酵肉制品加工過程中一般要求在16～24h內使發酵體系pH應降到5.3以下[22]。因此,產酸能力是衡量發酵劑優良性能的一個重要指標。

四株乳酸菌在MRS液體培養基中培養24h后,pH均在5.0以下,滿足發酵要求。由此可見,M5-4-2、M1-4、M3-4、M9產酸速度快,滿足發酵要求。

圖3 四株乳酸菌38h內的產酸變化Fig.3 Changes of acid produced by four Lactobacillus during 38h fermentation

2.3.3 耐鹽性 圖4表明,不同鹽濃度對同一菌株菌體的生長影響均存在顯著差異(p<0.05),在2%鹽濃度培養基上培養48h后,四種菌株的OD值降低百分率均小于10%,即添加2%的鹽對其基本無明顯影響。但當鹽濃度達到6%時,M5-4-2、M1-4、M3-4、M9的OD值分別下降了23.7%、27.80%、20.45%、21.09%,四種菌株的OD值下降百分率均在30%以下,表現出較強的耐鹽性。

表3 四種菌株在55～65℃ MRS液體培養基內生長情況Table 3 The growth condition of the four strains in the 55～65℃ MRS liquid medium

表4 四種菌株在55～65℃ MRS固體培養基內生長情況Table 4 The growth condition of the four strains in the 55～65℃ MRS solid medium

圖4 不同鹽濃度下菌體在48h的生長情況Fig.4 The growth condition of thallus at different concentration of salty in 48h注:標有不同字母表示有顯著性差異(p≤0.05),相同字母表示沒有顯著性差異(p>0.05)，圖5同。

2.3.4 耐亞硝酸鹽性 圖5顯示,四種菌株均有良好的亞硝酸鹽耐受性,當亞硝酸鹽濃度達到0.015%時,M5-4-2、M1-4、M3-4、M9OD值分別下降了19.58%、17.90%、17.41%、16.24%。四種菌株的OD值下降百分率均不超過20%,各個菌株間沒有明顯差異,符合肉制品發酵劑的要求。

圖5 不同亞硝酸鹽濃度下菌體在48h的生長情況Fig.5 The growth condition of thallus at different concentration of nitrite in 48h

2.3.5 拮抗性 已有研究表明,從對產品的風味和狀態的影響上來看,兩種或兩種以上菌種相配合,往往比使用單一種做為發酵劑會有更好的效果。這就要求配合作用的菌種間要有較好的共生作用,而不能有顯著的拮抗性[23]。根據前面多項實驗所得出的初步結果,本研究針對M5-4-2、M1-4、M3-4、M9的拮抗性進行實驗,結果見表2。結果顯示,四種菌株之間均無拮抗性,可以進行混合發酵。

2.3.6 發酵葡萄糖產氣 肉制品發酵劑應不具備發酵產氣的能力,以避免不良氣體對肉制品品質的危害[24]。本實驗結果表明,各菌株乳糖膽鹽發酵管均無氣泡產生,即均為陰性。因此,從發酵產氣角度考慮,4個菌株均符合肉品發酵的基本要求。

表2 四種菌株間拮抗效果比較Table 2 Comparison of antagonistic effect among the four strains

注:+為拮抗,-為不拮抗,/為同種菌株不需要進行拮抗性測試。

2.3.7 致死溫度 為避免后熟和儲存期間乳酸菌繼續發酵產酸,要求菌株具有相對較低的致死溫度是非常重要的[14],對四株菌的致死溫度進行了研究,結果見表3,表4。

表3和表4表明,四株菌在55℃與60℃條件下均能生長,但生長受到抑制;在65℃條件不能生長。因此四株菌在65℃條件下生長受到極大抑制,不能生長,滿足發酵要求,后熟和儲存期間乳酸菌不會繼續發酵產酸影響產品風味。

2.3.8 脂肪酶活力 前人研究發現,肉品發酵過程中若加入的發酵劑或污染的菌具有直接的脂肪降解能力,則會造成成品在貯藏銷售過程中脂肪降解生成游離脂肪酸,并進一步氧化產生羰基化合物及其它小分子化合物,導致酸敗味的產生[22]。因此,良好的肉品發酵劑應不具備脂肪分解活性。牛津杯法定性測定結果表明,各菌株培養皿菌落周圍均無藍色環,表現為陰性。因此,從脂肪降解角度來看,四種菌株均符合肉品發酵的基本要求。分光光度定量測定法:四株菌均不分解脂肪,OD值為0,所得結果與牛津杯法定性測定結果相同,所以可以判定不具備脂肪酶活力。

2.3.9 蛋白酶活力 前人研究認為,品質優良的發酵肉制品蛋白質的降解主要靠內源蛋白酶而非發酵劑的作用,內源蛋白酶降解蛋白質生成多肽、氨基酸等,促進了風味物質的形成[22],因此,良好的肉品發酵劑其胞外酶應不具備蛋白質分解能力。

牛津杯法定性測定結果顯示,四個菌株均未出現透明圈,為陰性,證明四種菌株胞外酶均不具有蛋白質分解能力,符合肉品發酵劑的基本要求。紫外光譜定量測定法測定,四株菌均不分解蛋白質,OD值為0,所得結果與牛津杯法定性測定結果相同,所以判定不具備蛋白酶活力。

2.4 益酵菌株的確定

通過上述發酵特性觀察發現,M5-4-2、M1-4、M3-4、M9培養16～20h后就進入穩定期培養液中產酸較快,4h時pH達4.00左右;M5-4-2、M1-4、M3-4、M9四種菌株具有較高的耐鹽特性,同時也具有較強的亞硝酸鹽耐受能力;四種菌株之間無拮抗性,可以復配混合使用;四種菌株均能發酵葡萄糖產酸但不產氣;在65℃下四種菌株的生長均受到嚴重抑制;四種菌株胞外酶均沒有蛋白質和脂肪分解能力。

鑒于M5-4-2、M1-4、M3-4、M9生長周期一致,且能快速進入穩定期菌量達到107cfu/mL,且發酵能力強,產酸快,24h后發酵體系pH為4.0以下,不產生有害氣體,能耐6%鹽、0.015%亞硝酸鹽,菌株之間沒有生長拮抗性,在65℃下生長受到極大抑制,不具有胞外蛋白酶和脂肪酶活力。為了縮短傳統酸肉發酵周期,提高產品營養價值和安全性能,故篩選這四株菌株為益酵菌株。

3 結論

研究確定了荔波傳統酸肉發酵期優勢菌為乳酸細菌,并進一步證明了四株優勢菌復配發酵具有優良的發酵性能包括:產酸性能、耐鹽性、共生作用以及良好的亞硝酸鹽的耐受性。同時,也顯示四株菌的復配應用能有效避免產氣、脂肪和蛋白質分解、以及后熟和儲存期間乳酸菌繼續發酵產酸等不良作用。研究表明:M5-4-2、M1-4、M3-4、M9四株菌發酵性能較好,為開發荔波酸肉產業化生產的純種發酵劑提供菌種資源。

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Study on identification and fermentative properties of superiormicroorganism in Libo sour meat from Guizhou during fermentation

ZHANG Qian1,GUO Xiao-yun2,FAN Li-ping1,WANG Yan1,YANG Dong-mei1

(1.Hangzhou Wanxiang Polytechnic,Hangzhou 310023,China2.School of Animal Husbandry and Veterinary of Guizhou Province,Guiyang 550051,China)

Objective:Characters of microbe flora change during fermentation were investigated for predominant species and fermentative properties of Libo sour meat in Guizhou. Methods:After being isolated and screened,Sour Meat strains were identified by API and 50CH standard system. Meanwhile,fermentative properties of the dominant bacteria were studied,such as capacity of produce acid,salt tolerance and enzyme activity. Results:Results showed that four strains obtained for their excellent characteristics in acid production and good flavor in fermented meat were M5-4-2,M1-4,M3-4 and M9 respectively,in which M3-4 and M9 were identified asLactobacillusbrevis,M5-4-2 asLactobacillusplantarumand M1-4 asL.lactissubsp.Lactis. Four strains of bacteria can be mixed together for being used as microbial starters culture due to their fermentative properties including salt-tolerant,nitrite-tolerant without inhibition each other,and proteinase and lipase of all these four strains have no capability to decompose protein and fat in meat. Conclusion:All these four strains can be mixed together used as purebred fermentation agent for Libo sour meat production and processing.

sour meat;fermentation;predominant species;fermentative properties

2014-08-19

張倩(1961-)，女，博士，教授，研究方向:食品營養與安全。

貴州省教育廳基金項目(黔教科[2008]009)；杭州市市屬高校優秀創新團隊資助項目[杭教高師(2013]54號)。

TS201.3

A

1002-0306(2015)13-0189-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.13.031